实体组织制备温和组织处理器原理

流式细胞术作为一种可在单细胞水平上对大量细胞进行快速、准确、多参数定量分析和分选的高技术，在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等方面的应用日趋广泛和深入。进行流式细胞术分析的前提是样品为单细胞悬液，根据不同实体组织成分的特点可选择不同的分散细胞的方法，以期达到单细胞产量高、细胞损伤小的目的。

在实体组织分散为单细胞的过程中，解离的方法有可能瞬间或持久地影响细胞的性质，比如，形态上显而易见的细胞膜破损，细胞表面上可出现泡状特征，还有一些是难以观察到的线粒体活性的变化、选择性膜表面抗原的丢失、蛋白质的丢失等，细胞受损程度受温度、pH值、处理时间等多种因素的影响。机械性或人工制备的单细胞，在某些性质上很可能已改变了原组织细胞特性，因此处理不同组织时，努力摸索方法，尽可能采用对细胞损伤小，产率较高的单细胞悬液制备方法，最大限度地保持细胞原有特性。

目前将组织分离为单个细胞的传统方法有机械法、酶消化法和化学法等，这些方法没有统一的标准，且非常浪费时间，获得的细胞的活性和得率相对低很多，美天旎研发的gentleMACS组织处理系统结合机械法和酶消化法，使用自动化方式可以快速温和、安全、省时、标准化、便捷、自动化的从组织(脾脏，肝脏，肺部，肿瘤，表皮，神经组织....)中分离单个细胞悬液，也可将组织块制备成匀浆(如蛋白提取，核酸提取)。下面介绍几种温和组织处理器方法。

(一)酶消化法

酶的作用原理主要有三方面：一是破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等，二是水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质，三是水解组织粘多糖物质。酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类有：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、弹性蛋白酶等。可根据分散的组织类型确定使用的酶类。需要注意的是使用条件和影响因素(酶浓度、酶效价、作用时间、pH值)等，如胃蛋白酶在碱性环境下失去活性，胰酶在中性溶液中活性欠佳。

酶消化法常规程序如下：

1、将适合于酶消化的组织置于离心管中。2、将选好的酶溶液1～2ml加入盛有被消化组织的试管中。3、常规消化20～30min(恒温37℃或室温)，消化期间间断振荡或吹打。4、终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞，以低速离心除去细胞碎片。5、加入PBS 2ml充分混匀，离心弃掉上清。再加入0.5ml PBS重悬细胞。6、将制备好的单细胞悬液进行荧光标记后上机检测或保存备用。

(二)机械法

机械法分散实体组织包括：用剪刀剪碎组织或用锋利的解剖刀剁碎组织，用匀浆器匀浆，用线注射针头反复抽吸细胞等，最后用300目尼龙网过滤细胞得到温和组织处理器。

1、剪碎法

(1)用剪刀将组织剪至匀浆状。(2)加入10ml生理盐水。(3)用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管内。(4)离心沉淀1000rpm/min，4～5min，再用生理盐水洗3次，每次以短时低速(500～800rpm/min)离心沉淀去除细胞碎片。(5)以300目尼龙网过滤去除细胞。(6)选择适当的固定液(70%冰乙醇等)固定细胞或低温保存备用。

2、网搓法

(1)将100目、300目尼龙网扎在小烧杯上。(2)把剪碎的组织放在网上，用眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直到将组织搓完。(3)收集细胞悬液，离心沉淀细胞500～800rpm/min，2分钟。(4)固定细胞或低温保存备用温和组织处理器。

3、研磨法

(1)先将组织剪碎成1～2mm3小块。(2)放入组织研磨器中加入1～2ml生理盐水。(3)转动研棒，研至匀浆。(4)加入10ml生理盐水，冲洗研磨器。(5)固定或低温保存细胞，备用。

(三)化学处理法

化学处理法的主要原理是：将组织细胞间起粘连作用的钙、镁离子置换出来，从而使细胞分散下来。

1、温和组织处理器试剂配制

胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g加PBS(pH7.0)200ml，浓度为0.125%，EDTA0.2g加PBS(pH7.0)100ml，浓度为0.2%。各取40ml混合，分装后置0～4℃冰箱保存，使用前过滤即可使用。

2、实验方法

(1)将组织切成薄片，置于试管。(2)首先加入EDTA液5ml，室温下0.5小时，离心弃之。(3)加入胰酶-EDTA液5～10ml，置37℃恒温水浴30min，间断振荡3～5次。(4)用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000rpm/min，5分钟。再以生理盐水洗2～3次，离心500～800rpm，1～2分钟。(5)将细胞固定或低温保存备用温和组织处理器。化学处理法获得的细胞存活率低，细胞产量较低，细胞碎片和细胞聚集量不稳定。

(四)美天旎组织解离系统

1、使用方法：

将20~4000mg大小样本或0.3~10ml样本与组织所对应得解离试剂盒共同加入至组织解离管并旋紧管盖;把解离管安装至gentleMACS温和组织处理器上，启动程序并运行，最终得到温和组织处理器或亚细胞结构。

2、适用组织：

(1) 制备温和组织处理器• 人类或小鼠的肿瘤组织• 神经组织• 小鼠的脾脏，肺，固有膜，肌肉，上皮组织，肝脏• 人类或小鼠的皮肤等(2)制备组织匀浆• 从新鲜或冻存样本中提取DNA，RNA• 提取蛋白• 分离细胞器• 测定病原菌滴度等

3、产品特点

(1)温和有效：gentleMACS使用专门的一次性分离管(C管和M管)，管盖上带有特殊设计的转子和定子，对样本减少损伤，保证了细胞活性，同时得到了高回收率。(2)一个机器支持多种用途：生成温和组织处理器和制备亚细胞物质。C管可以得到单细胞悬液，用于细胞分选，分析或者是培养。M管可以将组织和细胞匀浆，用于分离亚细胞物质(如蛋白，核酸)。(3)无菌分离：C管和M管的中心都有一个用隔膜封闭的小孔，能保证在无菌条件下，在封闭系统中安全地处理样品。(4)用户安全：针对一些感染性样本处理采用封闭系统处理，比如细菌病原感染的样本，完全不需要打开试管盖，即可添加酶以及其他溶液，或者取出分离出来的细胞或者匀浆溶液，保护实验室操作人员安全。(5)结果可靠：标准化流程操作，减少人为操作误差，使结果有高度可重复性。

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