【摘要】 光学荧光显微镜因其无损性和高特异性，一直是生物实验室研究的必备选择。

光学荧光显微镜因其无损性和高特异性，一直是生物实验室研究的必备选择。与二维显像相比，三维超分辨显微成像技术在生物学研究中具有明显的优势。由于光学衍射效应（DiffractionEffect），经典的单镜头显微镜系统在轴向(薄厚方向)中的分辨率表现并不好——即使是新的超分辨率显微镜技术也无能为力。为了追求三维一致的分辨率，研究人员开发了基于对置双镜头的4Pi显微镜架构，并开发了相应的超分辨率版本。然而，由于鬼影效应（GhostImage）厚样显像一直是4Pi超分辨显微成像技术的“禁域”，与样品像差累积效应。

由多个研究机构组成的联合研究小组于2021年5月31日在NatureMethods上发表了一篇文章。-dimensionaladaptiveopticalnanoscopyforthickspecimenimagingatsub-50-nmresolution[1]提出了一种全新的自适应光学，可用于4Pi显微镜架构。（AdaptiveOptics）该策略成功将4Pi超分辨率显微镜的应用范围扩展到更厚的生物样品，如全细胞和组织。通过与isoSTED显微成像技术的结合，作者首次在实验中从整个30-35μM厚生物样品内稳定获得3D亚50nm分辨率，并借此对一系列亚细胞结构进行了细致的3D成像。

 

与原来的4Pi超分辨显微镜，特别是isoSTED相比，作者对上述目标进行了一系列开创性的系统更新(如图1所示)。第一，它们改变了激光布局，简化了光路结构，提高了成像过程中系统的稳定性；从而利用空间光调制器（SpatialLightModulator）为了克服鬼影效应，打破厚样显像的理论束缚(否则，为了防止鬼影的影响，isoSTED显微镜的显像深度只能达到数百纳米)。第二，通过对光束的偏振调节，系统噪声水平大大降低。最后，基于早前推导出的4Pi像差模型[3]，他们使用了两个变形镜。（DeformableMirror），为保证系统分辨率的稳定性，建立了步进式自适应光学像差补偿策略。根据标准样品的显像结果(如莹光颗粒样品或神经组织切片样品)，作者开发的4Pi超分辨率显微镜可获得35-50nm的三维和各向异性分辨率，无论是在表面还是深入样品内部。

 

在随后的实验中，作者证实了他们的显微镜具有混色、三维和全细胞显像能力，通过显示单细胞样本。对于微管、联合体、高尔基体、内质网、线粒体等各种细胞器具有良好的显像效果。如图2所示，它们是高尔基体的多色显像结果——囊泡，可以很好地区分高尔基体的层状结构。

 

（GolgiApparatus）和囊泡（COPIVesicle）图像结果。在这些图像中，绿色和洋红分别是GM130和GM130的免疫荧光标记。βCOP蛋白。图a和b显示了同一显像区域的两个侧面切面。

与单细胞样品相比，组织切片样品的显像更具挑战性。由于组织样品的折射率分布较为复杂，光散射背景的噪声和像差大幅增加。与此同时，为防止压缩失真，需要达到单细胞样品厚度的组织切片厚度，这使得高分辨率显像变得特别困难。此前，还没有使用4Pi超分辨率显微镜对组织成功显像的报道。作者利用他们开发的显微镜对于果蝇卵中的环沟。（RingCanal，显像也被称为胞质桥CytoplasmicBridge)。图像结果(如图3所示)清楚地显示了HtsRC和F-actin蛋白在空间布局和数量上的巨大差异，为进一步揭示其相关功能提供了可靠的依据。此外，作者还利用同样的技术对神经突触进行了显像，并进一步测量了Bassoon和Homer1之间的距离和统计分布，验证了他们在处理生物问题时显微镜的定量分析能力。

 

图片中，HtsRC和F-actin蛋白分别标有免疫荧光。

本文作者基于该策略开发的自适应光学策略和超分辨显微成像技术，不仅扩大了原有技术的应用范围，而且普遍适用于整个4Pi显微成像技术，为更多生物学家利用4Pi超分辨显微成像技术处理自己感兴趣的科学研究问题带来了可能性。此外，该技术路线还为探索多焦点并行检测技术等更具突破性的显微光场调控方法提供了良好的启发。

这篇文章的第一个共同作者是郝翔博士，牛津大学的EdwardS，现任浙江大学光电科学与工程学院研究员。.本文的通讯作者是耶鲁大学的JoergBewersdorf教授，Allgeyer博士和耶鲁大学的Dong-RyoungLee博士。