【摘要】 显微镜配有两个加热的压电驱动PP支架，其位于物镜BFP和选择区域衍射(SAD)平面

低温透射电子显微镜(TEM)对辐射敏感的生命科学对象的弱对比对其结构的测定构成了基本的物理限制。也被称为弱相物体(WPOs)，生命科学样品通常由低原子序数的材料(例如水和碳)组成，它们只会引起入射电子波的微弱变化。

 

因此，它们的结构特征在聚焦TEM图像中几乎不可见。提高WPOs对比度的一种常用方法是通过物镜散焦来实现，然而这会导致分辨率和图像可解释性的损失[1]。物理相位板(PPs)通过在物镜的后焦平面(BFP)中诱导电子波的散射部分和非散射部分之间的相对相移来产生相位对比，而无需施加强离焦。

 

自Zernike于1942年首次将相对比成像的概念引入光学显微镜，并于1947年由Boersch提出将其应用于TEM以来，已经开发了许多PP设计。瞬变电磁法PPs主要分为薄膜法和静电法。基于Zernike碳膜的PPs对通过薄非晶碳(aC)膜传播的散射电子施加相移，而未散射的电子不受影响，因为它们通过aC膜中心的一个小微结构空穴传播。在无孔PP (HF)的情况下，静电充电是一种有益的效果，也被称为Volta PP。在物镜的BFP中放置无开口的连续交流膜，用强零级光束(ZOB)照射交流膜，形成相移斑。

 

这一斑块可能是由于碳污染沉积，相当于正电荷，也可能是由于电子刺激解吸导致负电荷，导致交流膜的电子功函数发生局部修饰。施加相移的分布与ZOB的强度分布相似，但扩展到更高的空间频率，特别是在负电荷的情况下。另一个有益的影响是相移轮廓的逐渐开始，这导致条纹效应的实质性减少。此外，相衬成像的最大物体尺寸不受切断频率的严格限制。不利的一面是，相位轮廓的平滑梯度会在成像物体周围产生光晕。

 

图1. 冻显微镜的电子光学装置[1]

 

一个冷却的样品转移室可以储存多达3个冷冻样品。显微镜配有两个加热的压电驱动PP支架，其位于物镜BFP和选择区域衍射(SAD)平面(参见图1)。HFPP实现在物镜BFP(焦距5 mm)中，而静电Zach PP插入在SAD平面中。利用改进物镜微型透镜作为转移透镜，可将SAD平面转化为共轭焦平面(焦距15.8 mm)[29]。物镜继续在这种“SA MAG”模式下工作。在此模式下，球差系数Cs仅在5.2 ~ 5.29 mm之间转化。

 

PP持有人配备了一个单独的泵负载锁系统，使PP快速交换。在300 keV的电子能量下，两个垂直取向的T4s嵌入在150nm厚的玻璃化冰中，估计的目标波函数相位如图2所示。T4头部的复杂结构用直径为85 nm的圆柱体来近似，尾部螺旋蛋白结构的4 nm周期性用厚度为21 nm的等距定位长方体来简化。为了模拟，假设T4头部和尾部的平均内电位为V0≈6 V，这与其他基于dna的生物分子复合物(如核小体核心颗粒)相当。

图2. 两个垂直取向T4s在300 kV下嵌入150 nm厚的玻璃化冰中的模型物波函数，然后进行相移PP [1]

 

[1] Obermair M , Hettler S , Hsieh C ,et al.Analyzing contrast in cryo-transmission electron microscopy: Comparison of electrostatic Zach phase plates and hole-free phase plates[J].Ultramicroscopy, 2020, 218:113086.

 

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