基础荧光测试入门

荧光，是一种物质光致发光的冷发光现象。物质基本的荧光性能可用荧光分光光度计和稳态瞬态荧光光谱仪进行表征。常规的荧光光谱仪主要来测试物质的激发光谱、发射光谱、量子产率、荧光寿命、三维荧光等方面的信息，其它的像磷光、上转换发光、变温光谱、荧光偏振以及激光诱导荧光等性能，也可通过配置适宜的附件进行检测分析

图1 不同样品紫外灯下发光的照片^{[1] [2] [3]}

1.基本概念

发射光谱 (Photoluminescence spectra, PL)：固定激发光波长，探测(扫描)不同发射波长处的发射强度，得到材料发射强度随发射波长变化的谱图。

激发光谱（Photoluminescence Excitation Spectra, PLE）：固定发射光波长，探测(扫描)不同激发光波长条件下的发光强度，得到材料（此固定发射波长的）发射强度随激发波长变化的谱图。

量子产率（Quantum Yield, QY）：表示物质发生荧光的能力，数值在0~1之间，反映荧光辐射与其他辐射和非辐射跃迁竞争的结果，具体可分为内量子产率和外量子产率。

荧光寿命( Fluorescence Lifetime)：当激发停止后，分子的荧光强度降到激发时最大强度的1/e所需的时间，它表示粒子在激发态存在的平均时间，通常称为激发态的荧光寿命。

上转换发光（Upconversion Fluorescence）：又称反-斯托克斯发光，斯托克斯定律认为材料只能受到高能量短波长的光激发，发出低能量长波长的光，而上转换发光的材料在长波长激发下，可持续发射波长比激发波长短的光。

温度猝灭（Temperature Quenching）：发光材料由于不同特性和热稳定性的影响，随着温度的上升，其发光强度下降，发射光谱红移。

2.模块化的爱丁堡设备

爱丁堡FLS980                                            爱丁堡FLS1000

图2 爱丁堡FLS980、FLS1000设备外观^{[4] [5]}

爱丁堡是一家专注于生产和研发高性能研究级光谱仪的公司。其推出的FLS980和FLS1000是当前较为先进、功能强大、模块化搭建的稳态瞬态荧光光谱仪（图2）。FLS系列注于稳态及时间分辨光谱测试，具有超高的灵敏度。通过搭配适宜的组件和附件，可以满足荧光、量子产率、磷光、近红外、荧光寿命等一系列测试需求。根据测试需要，可设置不同的光源和不同的测试模式，表1列举了不同测试模式对应的数据采集技术：

表1 不同测试模式对应的光源和数据采集技术^[5]

爱丁堡光谱仪的组成相对复杂，这边只着重讲一下光源和探测器部分：

（1）光源：荧光光谱仪上使用的光源可归类为稳态光源和瞬态光源。稳态光源一般是光谱及能量连续输出的氙灯，主要用于稳态谱、量子产率的测试。瞬态光源为频率可调、具有特定脉宽的脉冲输出光源，主要有微秒灯、纳秒灯和皮秒脉冲激光器等，主要用于荧光寿命的测试。以爱丁堡FLS980光谱仪系列为例，通常配备三种标准光源：连续氙灯（稳态光源）、μF2微秒脉冲氙灯、nF920纳秒灯。另外爱丁堡公司配置的皮秒级脉冲激光器（EPLs）和LED（EPLEDs），是纳秒级别的荧光寿命测试最常用到的高性能光源。

（2）探测器：爱丁堡设备内含高增益光电倍增管(PMT)检测器，适用于稳态谱和时间分辨过程中的光子计数收集。最常用到的是可见的红敏探测器，其对应光谱探测范围200-870 nm，建议探测范围300-750 nm。探测器通常都需要相应的制冷装置，以减少黑暗计数率，提升信噪比，可见探测器有自带半导体制冷片，为探测器提供-20 ℃的工作温度。另外常用的还有近红外探测器，需要外加液氮制冷达到77 k的工作温度对应光谱探测300-1700 nm（建议探测范围800-1600 nm）。还有一些其它探测器，比如扩展范围的红敏探测器、微通道板光电倍增管(MCP-PMTs)、热电冷却的InGaAs探测器等，会根据实际应用需要配置。

3.集成化的滨松设备

除了爱丁堡的仪器，滨松的设备也常用来测试材料的荧光量子产率。滨松的绝对量子产率测试系统，测试波段覆盖从紫外到近红外短波区域。如图3，滨松系统主要包含一个氙灯型激发光源、单色仪、积分球和能同步测量多个波长的多通道光的CCD探测器(Charge-coupled Device电荷耦合器件)。

图3 滨松系统内部构造^[1]

PMT是单通道光探测器，虽然灵敏度高，但只能读取分立的谱线，采谱速度慢。相比PMT，滨松产率设备配置的CCD探测器主要特点是多通道性，可读出一段光谱区域内的连续光谱，实现“全谱测定”，测试响应速度更快，特定波长范围下的相对检测噪音也低。

滨松系统模块化的设置，使得光源、探测器等主要部件的配置更灵活。这边主要是讲滨松设备在产率测试中的应用，当然其它的激发发射等测试也是可以实现的。根据实际应用的需要，可配置激光器、高能氙灯或者双探测器等组件分别实现上转换QY、近红外QY和长斯托克斯位移样品的测试。

除了爱丁堡FLS系列、滨松的光谱设备，能实现常规荧光测试的还有很多，像日立FL系列荧光光度计、HORIBA的荧光光谱仪、爱丁堡FS5等等。不同光谱仪的组成复杂程度不同，但它们的基本结构是相似的：光源照射样品，样品发出荧光，探测器接收信号，光电流经处理得到相应数值。

4.测试项目及数据展示

4.1 常规激发发射谱

图4是爱丁堡软件界面呈现的激发发射谱测试结果。左边是激发谱，监测波长是500 nm，右边是发射谱，激发波长390 nm.主要的参数信息为 Step（步幅）：1 nm；Dwell Time（每步幅积分时间）：0.2 s；Repeats（重复次数）：1，激发发射狭缝为1 nm，激发发射狭缝均为0.4，勾选了激发发射校正。

图4 爱丁堡测试界面，上边是激发谱，监测波长λem = 500 nm）；右边是发射谱，激发波长（λex = 390 nm）

爱丁堡系列的光谱仪通常自带滤光片功能，通常不需要再加滤光片。发射光谱扫描一般从激发波长往后 20-30 nm 处开始，最长一般扫到870 nm。常规光谱亦可用小光谱仪（日立F7100 等）测试，可能有倍频峰的影响，如325 nm 激发在650 nm 处有倍频峰。如倍频峰在光谱测定范围内有影响，测试时可加适当的滤光片尽可能消除。小光谱仪测试速度快，测动力学过程更适用。薄膜等荧光较弱的样品，对分辨率要求不高的，可用小光谱仪测试。

4.2 量子产率（QY）

量子产率是材料荧光性能的重要指标，按定义可区分为： 

内量子产率：产生的光子数与样品吸收的光子数之比；

外量子产率：产生的光子数与所有入射的光子数之比。

按照定义，内量子效率乘以吸收系数等于外量子效率，吸收系数小于1，因此内量子产率肯定要高于外量子产率。由定义也可以知道，因为和材料吸收相关，所以内量子产率不等同于发射谱强度，样品荧光强、测发射谱时强度高不代表测产率时产率也高。

测量子产率时，需要用到积分球将所有散射光、发射光收集，先后测试样品和参比样两条曲线。测固体样通常选择BaSO₄标样或者空的石英皿作参比；测液体样通常选择对应的溶剂作参比。如图5，测试参比样的曲线中，激发光照射到参比样，获得激发光谱，即总光子数。然后在样品容器中放入样品，同样条件下，激发光照射获得未吸收光子数和发射光子数。通过发射光子（绿色区域）和吸收光子数（蓝色区域）的比值，计算出内量子产率。

图5 绝对量子产率的测试原理^[6]

爱丁堡和滨松的设备都可以用来测试量子产率。图6、图7分别展示了爱丁堡和滨松仪器产率计算时的界面，两者界面不太一样。

图6 爱丁堡设备软件产率计算的界面

图7 滨松设备软件产率计算的界面

4.3 荧光寿命

在激发光源的照射下，一个荧光体系向各个方向发出荧光，当光源停止照射后，荧光不会立即消失，而是会逐渐衰减到零。当激发停止后，分子的荧光强度降到激发时最大强度的1/e所需的时间即该荧光体系的寿命（τ）（图8）。

图8 荧光寿命τ的定义^[7]

荧光寿命本质上测试的是样品的某波长发射的时间衰减曲线，也叫做时间分辨衰减谱。和测稳态谱的主要区别是，寿命测试要选择合适的脉冲光源，调整好合适的脉冲频率。利用一定波长的脉冲光激发样品，然后监测某个波长的发射强度在不同时间通道累积下来的光子数，纵坐标为荧光强度（光子计数），横坐标为时间（t），其记录的是具体某一波长的荧光强度随时间的变化。

图9 爱丁堡设备测试的荧光衰减曲线

时间相关单光子计数（Time-Correlated Single Photon Counting，TCSPC）技术是以统计学为基础，也是目前最成熟、最准确的荧光寿命测定方法。下文展示的数据也是基于TCSPC技术的爱丁堡设备的相关数据。图9展示的是爱丁堡设备测试荧光衰减曲线，激发波长365 nm，监测波长650 nm，计数收集到1000。 

如上所述，荧光寿命的测试，测试的结果是光源激发下所监测的发射波长的荧光衰减曲线。除此之外，一般工程师会给相应的寿命拟合结果（图10）：拟合的曲线（绿色线）、拟合的加权残差（紫色线）、拟合的寿命τ₁ (τ₂、τ₃)和它们对应的占比 B₁ (B₂、B₃)。 

图10 爱丁堡设备测试的荧光衰减曲线及拟合结果

平均寿命τ_ave可通过τ值和B值代入图11中的公式计算获得。平均寿命τ_ave的两种表达式本质上是相同的，因为Rel%本身就是τ值和B值的函数，实际应用中第二个式子更为简化、计算更方便。图10中χ2表示置信因子，当0.8<χ2 <1.3时，表示拟合结果可靠适用。工程师一般用爱丁堡仪器自带的软件给出相应合适阶数的拟合，该拟合结果仅供参考。结合自身样品，如需其它阶数的结果，可用origin快速拟合。

或者

图11 平均寿命的计算公式

4.4其它常规测试

1. 近红外光谱

现在除了发光在可见光区的发光材料，发光在近红外第一窗口（NIR-I，700 nm~900 nm）和近红外第二窗口（NIR-II，1000 nm~1700 nm）的材料得到了广泛的关注。对于生物成像领域的应用，近红外发光材料相比可见光区的发光材料，具有优良生物组织穿透性和低背景的荧光干扰。 

近红外光谱测试需要用到近红外区的探测器，如近红外的PMT探测器、Si基探测器或InGaAs光电探测器。实际应用中，例如用爱丁堡FLS1000配备的近红外探测器测试时，需先将探测器外加液氮制冷达到77 k，最大程度减小暗噪声，光谱扫描范围建议在800-1600 nm。因为和可见光属不同探测器，一般不再测试激发谱。

2.磷光/延迟荧光光谱

磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。对于特定体系材料，磷光的发光波长比荧光长，而延迟荧光的峰位和荧光保持一致。

在实际应用中，例如用爱丁堡FLS1000测试材料的磷光、延迟荧光光谱时，通常有两种方法。一种是时间分辨的发射光谱（TRES）方法，测量不同监测波长的荧光衰减作为发射波长的函数，建立一个三维的时间分辨光谱，再通过Fluoracle 软件集成的TRES 切谱功能，设置指定的时间窗口进行切谱即绘制出稳态光谱图。另一种方法是配置带有门控功能的PMT检测器，配合脉冲光源，选择门控延迟时间做到延迟检测，将磷光、延迟荧光与荧光分离。

3.上转换发光

上转换发光是指材料在长波长激发下，可持续发射波长比激发波长短的光。上转换过程的三种形式：激发态吸收、能量传递及光子雪崩，测试常用光源有808 nm、980 nm激光器。迄今为止，上转换材料主要是稀土元素掺杂的固体化合物，利用稀土元素的亚稳态特性，可以吸收多个低能量的长波辐射，从而让人眼不可见的近红外光转化为可见光。

4.热猝灭

热猝灭也称为温度猝灭，是指各种发光材料随着温度的上升，其发光强度降低的现象。热猝灭是发光材料中普遍存在的现象，主要源于无辐射跃迁几率随温度升高而增大。

在材料的实际应用中，发光材料的工作温度明显高于室温，因此研究材料的热猝灭性能和机理，可以为制备高效和高工作温度的荧光材料提供一定的参考。爱丁堡FLS系列的仪器，通过配置的冷热台、冷却循环水系统（测低温用）实现样品的变温测试。

参考资料和文献

[1] 张纪泽. 准确、简单测量固体及液体发光材料绝对量子产率的评价方法 [Z]. 滨松光子学商贸（中国）有限公司

[2] 图片来源：厦门大学解荣军课题组

[3] Maksym V. Kovalenko, et al. Nanocrystals of Cesium Lead Halide Perovskites (CsPbX3, X = Cl, Br, and I): Novel Optoelectronic Materials Showing Bright Emission with Wide Color Gamut[J]. Nano Lett. 2015, 15, 3692

[4]  FLS980 User Guide[Z]. Issue No. 2. Edinburgh Instruments Ltd.

[5]  FLS1000 User Guide[Z]. Issue No. 1. Edinburgh Instruments Ltd.

[6] 张纪泽. 绝对量子产率产品快速入门及防污染手册[Z]. 滨松光子学商贸（中国）有限公司

[7] 图片来源：https://www.sohu.com/a/143926821_472924

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