【摘要】 虽然冷冻电子显微镜提供最高分辨率，但通过在扫描电子显微镜 (STEM-in-SEM) 中执行扫描透射电子显微镜，可以使用低压电子显微镜以高对比度有效地表征较大的结构。

软材料和生物材料的电子显微镜，或“软电子显微镜”，对于大分子的表征至关重要。软显微镜通过增强对比度同时保持低电子剂量来控制，样品制备和成像方法由感兴趣特征的长度尺度驱动。虽然冷冻电子显微镜提供最高分辨率，但通过在扫描电子显微镜 (STEM-in-SEM) 中执行扫描透射电子显微镜，可以使用低压电子显微镜以高对比度有效地表征较大的结构。

 

此处，STEM-in-SEM 演示了四叶蛋白组装，必须检查构建体中蛋白质的排列。 STEM 图像模拟显示了未染色结构在 SEM 级电压下的理论对比度增强，并且具有多种 STEM 模式的实验图像显示了负染色蛋白质可能的分辨率。该技术可以扩展到复杂的蛋白质组装、更大的结构（例如细胞切片）和混合材料，使 STEM-in-SEM 成为一种有价值的高通量成像方法。

 

图1. 电压对空间分辨率的影响。 (AC) 使用 Helios SEM/FIB 在 5、10 和 15 kV 下获取的 HAADF STEM 图像。分辨率在 5 kV 时明显下降，可能是由于聚光镜中的色差或由于信号低而难以调整焦点和像散。比例尺 20 和 10 nm（插图）。 (D) 在 5 至 30 kV 范围内计算的 STEM 对比度传递函数，表明预期分辨率随着束电压的增加而增加。 (E) 未染色结构的模拟图像（顶部，黑色虚线）和 UF 染色结构的实验类平均图像（底部，蓝色实线）的强度分布。【1】

 

迄今为止的工作主要集中在电子束电压的对比度变化上。在评估 STEM-in-SEM 对于纳米级生物结构的实用性时，还必须考虑空间分辨率。图1A-C 显示了在 Helios SEM/FIB 上以 5、10 和 15 kV 获得的 UF 染色四角皮酶的 HAADF STEM 图像。该仪器在 20 kV 及以上电压下需要比此处使用的更长的工作距离，因此更高电压下的分辨率无法比较。与 BF 成像一样，我们观察到分辨率随着电压的降低而降低，但四个波瓣仍然是可分辨的。分辨率的降低可能是由于较低电压下色差影响的增加，也可能主要是由于低信号和高有机污染率造成的实际限制所致。如图4D所示，STEM对比度传递函数根据电压限制空间分辨率；该函数计算由透镜像差引起的电子波相移。20 k (1/Å) 的最大值（空间频率）代表真实空间中可能的最高分辨率。

 

这表明电压越低，最大空间频率越低，从而导致空间分辨率降低。然而，5 kV 时大约 0.1 Å−1 的最大空间频率转化为 10 Å (1 nm) 的信息限制，足以对 3−4 nm 蛋白质组件进行成像的分辨率。电子源退相干因电压而异，并且取决于显微镜，因此光束形状和透镜校正光束形状的有效性可能会导致某些电压下空间分辨率的限制。固定和染色对于室温成像至关重要，负染色会根据染色颗粒的大小降低分辨率；对于超滤，此误差约为 0.5 至 1 nm。7 为了评估染色对分辨率的影响，图1E 比较了类平均图像和 15 kV 下模拟图像的两个蛋白质叶侧面的强度分布。对模拟图像进行高斯滤波，以去除蛋白质和背景胶片中的细节以进行比较。实验图像和模拟图像中每个蛋白质叶上最亮点之间的距离相似，约为 6 至 6.5 nm。

 

【1】Scanning Transmission Electron Microscopy in a Scanning Electron Microscope for the High-Throughput Imaging of Biological AssembliesKelly A. Parker, Stephanie Ribet, Blaise R. Kimmel, Roberto dos Reis, Milan Mrksich, and Vinayak P. DravidBiomacromolecules 2022 23 (8), 3235-3242DOI: 10.1021/acs.biomac.2c00323

 

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