【摘要】 AFM对导电样品没有要求，因此在聚合物和生物科学等新领域开辟了可能性。

1986年，Binning、Quate和Gerber发明了一种新型显微镜——原子力显微镜(AFM)。AFM对导电样品没有要求，因此在聚合物和生物科学等新领域开辟了可能性。AFM不是一个经典的显微镜。没有光学聚焦在样品上的辐射，无论是光还是电子。这是一台机械显微镜。成像是完全基于表面形貌的物理渲染，通过光栅扫描(之字形运动)在样品上的触控笔。这给该技术带来了一定的限制，但也带来了如下所述的一系列优势。N Gadegaard[1]综述了原子力显微镜(AFM)在生物学方面的应用。介绍了显微镜的历史背景和发展，描述了仪器，样品制备和操作。AFM可以在许多与生物系统相关的不同模式下工作，包括地形、化学分析和与生物长度尺度相关的力。

 

图1 衬底(S)由压电晶体(箭头)移动。扫描样品时，使用从尖端反射的聚焦激光束(L)，象限检测器(D)检测顶部(T)的运动。[1]

 

原子力显微镜的构造很简单，从理论上讲，制作自己的原子力显微镜也不是特别困难。样品被移动，同时一个悬臂尖端检测样品的地形。它不是旋转表面，而是以与扫描电子显微镜(SEM)中电子束扫描表面相同的方式进行光栅扫描。然而，扫描比扫描电镜慢得多，并且通常图像采集需要5-10分钟。在SEM上没有“电视模式”。光栅扫描在两种配置中完成；表面相对于尖端被扫描，反之亦然。每种方法都有其优点。具有扫描尖端技术的仪器的一个特别优点是可以检查更大的样品。运动是由可以亚原子分辨率定位的压电晶体完成的。悬臂的运动通过聚焦在其顶点的激光束来测量。反射光在象限检测器上检测，该象限检测器可以分别确定与弯曲和扭转相对应的尖端的横向和垂直运动。AFM的示意图如图1所示。

 

在成像过程中，压电晶体的物理性质存在一定的缺陷。一个固有的问题是非线性运动和蠕变。这通常被观察到为扭曲的图像。AFM背后的原理意味着它不受1:1宽高比的约束。换句话说，它可以在相对较大的区域内检测分子层。为了便于样品操作，光学显微镜通常与原子力显微镜集成在一起。在更高级的设置中，可以合并荧光和/或共聚焦功能。

 

图2. (A)轻叩模式和(B)接触模式悬臂的SEM显微照片。插页显示提示的形状。[1]

 

AFM的最大优点是它几乎可以在任何环境下工作。为了在电子显微镜下观察生物标本，样品必须经过充分的制备。这包括固定、脱水和导电涂层的应用;每一步都可能产生样品伪影。这些程序是必要的，因为电子显微镜在超高真空中操作;因此，样品必须干燥，这需要细胞膜充分固定以进行必要的处理。此外，为了能够生成样品的图像，它必须涂上导电层。这些过程相对来说比较繁琐，而且必须注意保持细胞的原始形态。样品制备通常会导致样品收缩和细胞形态的变化。

 

AFM可以测量范围广泛的材料，通常只受物理尺寸的限制。如前所述，可访问的z范围通常只有大约1-20毫米。这意味着粗糙的表面不能作为AFM的基底。当观察分子实体时，通常使用的基质是云母、玻璃、硅或高度有序的热解石墨(HPOG)。云母和HPOG是最光滑的衬底，粗糙度仅为0.1 nm。云母是最常用的材料之一，因为它很容易获得，价格低廉，并且很容易通过切割晶体来制造干净的表面。玻璃和硅的粗糙度为0.3-0.5 nm，可以用酸处理清洗。

 

AFM在生物界越来越受欢迎，它提供了独特的可能性。此外，AFM与现有光学显微镜方法相结合的能力也带来了新的潜力。在成像或使用AFM施加特定力时，通过荧光显微镜跟踪生化过程的能力为信号传导途径和细胞反应提供了独特的见解。然而，原子力显微镜的使用也有局限性。它相对较慢的图像采集使得扫描或浏览大面积感兴趣的区域变得困难，但解决这个问题的开发正在进行中。

 

[1] N Gadegaard (2006) Atomic force microscopy in biology: technology and techniques, Biotechnic & Histochemistry, 81:2-3, 87-97.

 

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