【摘要】 冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 是一种强大的方法，可用于研究各种不同尺寸的生物大分子及其复合物的结构。

大分子组装体的详细三维结构对于理解它们的功能是必要的，这反过来又有助于理解生命。冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 是一种强大的方法，可用于研究各种不同尺寸的生物大分子及其复合物的结构。根据样本和成像条件，冷冻电镜具有三种不同的成像模式：单颗粒分析 (SPA)、冷冻电子断层扫描 (cryo-ET) 加上亚断层平均 (STA)/亚体积平均 (SVA) 和电子衍射。

 

Richard Henderson 和 Nigel Unwin 根据电子衍射数据揭示了第一个膜蛋白细菌视紫红质的结构。这导致人们开始了解生物分子的三维分子结构。此后不久，雅克·杜博谢 (Jacques Dubochet) 在二十多年前成功开发了一种独特的生物分子玻璃化方法。长期以来，人们一直认为具有内部对称性的有序二维阵列或生物分子可用于结构测定，以实现更好的分辨率。但由于与 X 射线相比分辨率较低（图像信息较少），电子显微镜的结构计算当时被其他人称为斑点学。

 

此后，成像和软件技术稳步改进，2013 年之后，随着直接探测器的发展和成功，世界见证了冷冻电镜的分辨率革命。现在，冷冻电镜（更具体地说是单粒子分析）已经达到了可以在近原子水平研究蛋白质复合物的分辨率。这项曾经是一项高度熟练且困难的技术现在已成为结构生物学中广泛接受的生物物理技术。本文对冷冻电镜的两种方法（SPA 和冷冻电子断层扫描）以及最近的研究进行了回顾。

 

图 1：最近通过冷冻电镜以近原子分辨率解​​析了各种分子量的代表性生物分子。 EM 数据库编号和重建分辨率显示在相应地图下方。第一行：(L) β-半乳糖苷酶， (M) 人 p97 结合 UPCDC30245 抑制剂，(R) 人 γ-分泌酶复合物。 中行：(L) TRPV1 离子通道， (M) 人血红蛋白 R) 酵母剪接体， 底行：(L) 大肠杆菌 RNAP sigma70 全酶和启动子 DNA 复合物， 胰岛素受体-胰岛素复合物， (R) 哺乳动物呼吸复合物 I 【1】。

 

理想的单颗粒样品必须是均匀的。但样品中的异质性可能因构象变化和灵活性而出现。先进的图像处理算法能够对异构样本进行分类和平均。

 

然而，样品的异质性有时限制了负染色电镜分析的结构测定。单粒子冷冻电镜在过去 10 年中得到了扩展，并进入了晶体学领域，以应对解决小、异质和难以结晶分子的挑战。迄今为止，单颗粒冷冻电镜因其无需任何晶体即可收集数据的优势，已经解决了包括许多重要膜蛋白在内的各种动态生物分子和大分子复合物的问题。电子晶体学长期以来一直用于研究许多重要的膜蛋白，例如细菌视紫红质、水通道蛋白、微管蛋白等。

 

但在这个单粒子冷冻电镜的黄金时代，许多生物学上重要的膜蛋白得到了成功研究。 一些使用先进 SPA 技术的著名作品已经以非常高分辨率 (~2–3 Å) 报道，包括重新审视的结构和一些小尺寸蛋白质。 图 1 显示了最近解决的生物分子宽范围分子量高分辨率结构的几个例子。

 

【1】Dutta, M. Recent Advances in Single Particle Cryo-electron Microscopy and Cryo-electron Tomography to Determine the Structures of Biological Macromolecules. J Indian Inst Sci 98, 231–245 (2018). https://doi.org/10.1007/s41745-018-0087-z

 

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