【摘要】 在混合培养中，PLFAs分析不能用于识别单个微生物物种，但它可以提供土壤中发现的微生物群落的总体指纹。

磷脂脂肪酸（PLFAs）是来自细菌和真核生物领域的微生物细胞膜的一部分。微生物产生不同链长和组成的PLFAs，作为维持细胞膜完整性和细胞功能以响应其直接环境条件的手段；因此，可以认为地理上分离但受到类似土壤条件影响的微生物群落会表达类似的PLFAs。链长在14到20个碳原子之间的土壤PLFASs通常被认为主要是细菌和真菌的来源。

 

在混合培养中，PLFAs分析不能用于识别单个微生物物种，但它可以提供土壤中发现的微生物群落的总体指纹。此外，由于PLFAs在细胞死亡后会迅速降解，因此它们可以被认为是可活土壤微生物群落的代表。该技术已被广泛用于表征各种环境中发现的微生物群落的结构组成，从森林到草原和农田。它已成功地应用于描述土壤对土地管理变化的反应，这些变化包括森林砍伐、石灰化、复垦，以及火灾、金属和碳氢化合物污染和虫害等干扰。

 

Sylvie A. Quideau等人1用单相氯仿混合物提取土壤样品中的脂质，用固相萃取柱分离磷脂与其他提取的脂质，磷脂的甲醇分解生成脂肪酸甲酯（FAMEs）；火焰电离检测器（GC-FID）毛细管气相色谱法分析FAME。采用1,2-二癸酸酯-SN-甘油-3-磷酸胆碱（PC(19:0/19:0)）两种标准品评估提取方法的总回收率，采用癸酸甲酯（MeC10:0）作为内标品（ISTD）进行GC分析。

 

脂肪酸用X表示：YωZ，其中X表示碳原子数，Y表示双键数，Z表示分子脂肪族（ω）端第一个双键的位置。后缀“c”和“t”表示顺式和反式几何异构体。前缀“a”和后缀“i”分别表示前支和异支，Me和OH分别表示甲基和羟基。GC运行后，通过观察10:0的峰值来检查样品是否获得了足够的ISTD。同时检查气相色谱标准品的响应，即添加了ISTD溶液的含有己烷的小瓶；这些应该没有其他的峰。

 

内部标准响应在所有运行中应该是相似的。图1给出了一个代表性的示例运行。大己烷溶剂峰在滞留时间（RT）约1.8 min时出现。ISTD标准峰（C10:0）在滞留时间（RT）为3.4 min时出现，而C19:0的RT为16.2 min。GC分析根据链长分离PLFASs，较长的链洗脱速度较慢；例如，C18:0在14.4 min洗脱，C16:0在10.8 min洗脱。

 

此外，该分析方案可以根据PLFAs的不饱和程度和双键的位置分离PLFASs；例如，C18:0在14.4 min洗脱，C18:1 9c和C18:1 7c分别在14.0和14.1 min洗脱（图1）。最后，可以分离出链长和饱和度相似但分支构型不同（anteiso vs . iso）的PLFAs；例如，C15:0i和C15:0a分别在8.6和8.7 min洗脱（图1）。

图1 代表性GC-FID色谱图。

图2 6种不同类型PLFA的相对丰度和总PLFA生物量。

 

以下PLFAs通常被排除在土壤微生物群落的分析之外：i)长度<14 C和>20 C的PLFAs，以及ii)峰面积小于总数0.5%的PLFAs。一旦排除了这些PLFAS，就可以对所有剩余PLFAS的响应求和，以获得总PLFAS生物量（干土壤的nmol/g）。

 

PLFAS数据的单变量分析（例如，ANOVA，在适当的情况下进行数据转换以满足正在进行的测试的假设）可用于比较样本组/处理中选定组的PLFAS总生物量和/或PLFAS生物量。例如，图2给出了不同PLFAS组的相对分布结果，如直链饱和PLFAS，中链（10-甲基）或末端分支的饱和PLFAS，单不饱和或多不饱和PLFAS，以及总PLFAS（干土nmol/g）的总和。在这个特殊的例子中，树木的年龄（从站点1到站点3减少）可以看到影响PLFAS总数和不同PLFAS组的相对分布。

 

图3 非度量多维尺度（NMDS）排序的PLFAs轴2和3的三维解决方案。

 

为了评估样本中PLFAS组成的整体模式，可以对所有PLFAS进行多变量分析。在选择多变量分析之前，需要对PLFAS数据进行必要的转换，以满足统计检验的假设和所要解决的研究问题，例如，通常使用Hellinger变换对数据进行相对化。图3显示了对图2中使用的相同数据进行非度量多维缩放（NMDS）排序的结果；NMDS是一种非参数的多变量技术，基于样本之间排名分数的相似性产生数据点的二维或三维定位。

 

综上所述，PLFA方案是一种相对简单的分析方法，在量化土壤微生物对环境变化和人为干扰的反应时非常有用。虽然遗传指纹等分子技术更适合于微生物群落的详细特征，但PLFA方法在提供总微生物生物量的定量信息方面具有优势。在研究实验室中，一个人可以在4天内轻松处理一组20个样本，发现这里提出的方案是一种可靠且可重复的评估土壤生物质量的技术。

 

通过将PLFA方法与稳定同位素分析相结合，可以大大扩展PLFA方法的功能。具体来说，将13C标记的底物添加到土壤中，可以通过对单个PLFAs的同位素分析来量化底物融入土壤微生物。此外，这种方法似乎是一个非常有前途的工具，阐明营养联系的土壤食物网

 

(1) Quideau, S. A.; McIntosh, A. C. S.; Norris, C. E.; Lloret, E.; Swallow, M. J. B.; Hannam, K. Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils. JoVE 2016,  (114), e54360. DOI: doi:10.3791/54360.

 

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