杂质比外泌体还多？带你实战外泌体TEM 表征

众所周知，胞外囊泡作为细胞间通信的 "信使"，在生理病理机制、临床诊断及药物递送等领域展现出巨大潜力。

然而在实际应用中，我们常会遇到，辛辛苦苦提取的外泌体做透射电镜（TEM）时，结果图像质量很差，充满杂质，杂质比外泌体还多，甚至提交了论文，审稿人却质疑电镜图片是否真的证明了囊泡结构？真的让人非常头疼。

看来，想揭开胞外囊泡的神秘面纱并不容易 —— 如何用透射电镜（TEM）看清它的真实模样？又该如何避免实验中杂质盖过囊泡的坑？

图注：充满杂质的TEM图像

用TEM看清外泌体的真实模样，有2种方式：正染色与负染色。那么，您的样本需要做正染色还是负染色？要了解电子染色后TEM形貌分析解读，我们必须需要了解正染色与负染色的特点和区别，才能判定哪种染色更能支持自己的实验结论。

①正染色：

机制：重金属盐（如醋酸铀酰、柠檬酸铅）与样品本身的组成成分（特别是膜上的脂质和蛋白质）结合，增加这些区域的电子密度。

图像特征：背景亮（电子穿透多），样品结构暗（电子散射多）。能清晰显示膜的“暗线”结构。

正染色是判断一个颗粒是否为膜性囊泡（如外泌体）而非单纯蛋白质聚集体的关键依据。

图注：正染色

②负染色：

机制：重金属盐染料将样品包裹，并填充其周围的凹陷处。染料本身是电子不透明的。

图像特征：背景暗（被染料覆盖），样品结构亮（电子可穿透）。由于染料在囊泡周围和塌陷中心堆积，形成了典型的杯状/茶托状外观，立体感极强。

需要注意的是，负染色显示的是颗粒的外部轮廓和拓扑结构，不能直接证明其是膜结构。

图注：正染色与负染色

那么，什么时候选择使用正染色？

当您的研究对象可能存在争议时（如区分外泌体和非膜性的蛋白质聚集体或脂蛋白：蛋白质聚集体在正染色下没有清晰的膜边界，而是均一的暗色团块）；

当研究新型或非典型囊泡时，要确认其膜结构；

当您建立一种新的分离方法，并需要严格证明该方法确实能分离出膜性囊泡时。

提供正染色的照片，能为您“观察到的是外泌体/微囊泡”这一结论提供最强有力的证据，让审稿人无可挑剔。

什么时候负染色就足够了？

在大多数常规研究和日常实验中，负染色是首选，因为它更快捷、更直观。

日常实验的快速评估：在分离外泌体后，想快速知道样品里有没有囊泡、数量多不多、背景干不干净；或作为多种鉴定方法的一部分：当您的数据集中已经包括了Western Blot（标志蛋白）、NTA（粒径分布） 等功能学数据时，负染色提供的形貌照片作为辅助证据已经足够有说服力。

目前绝大多数论文中展示的漂亮、立体感强的“杯状”外泌体电镜图，都是负染色的结果，这已成为该领域的惯例。

不管哪种染色方法，如何避免实验中杂质盖过囊泡的坑？这个问题的解决策略是，必须提高样品纯度与浓度。

而对于不同的样品，也有不同的策略去去除杂质，我们以最常见的细胞上清和血液样本举例：

1.细胞培养上清：

主要杂质：细胞碎片、无定形蛋白质、血清中的脂蛋白（如果使用的血清未经过超速离心去除外泌体）。

解决方案：

保证细胞状态：使用低代次细胞，在对数生长期（80-90%汇合度） 收集上清，避免细胞过度融合和死亡。

使用“干净”血清：使用通过超速离心预处理过的无外泌体血清。

优化收集时间：换用无血清或低血清培养基后，收集时间不宜过长（通常12-48小时），以减少死细胞和碎片。

图注：细胞上清样品纯化前后对比

2.血清/血浆：

主要杂质：脂蛋白（如乳糜微粒、VLDL、LDL、HDL）、血清白蛋白等。

解决方案：

必须进行纯化。蔗糖密度梯度离心是去除这些杂质，尤其是与外泌体密度重叠的HDL的首选方法。

通过NTA测定，使用颗粒浓度做指标，其颗粒浓度建议 > 1 x 10^11 particles/mL，以保证在电镜网格的一个视野中能看到足够多的、有统计意义的囊泡。

图注：血清样品超离与纯化前后

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