PCR实验常见失败原因及排查方案

PCR 实验失败的表现主要有无扩增条带、非特异性条带过多、条带弥散、扩增条带强弱异常等四类，对应的原因和排查方法如下：

一、 无扩增条带（阴性结果，阳性对照也无条带）

可能原因

核心试剂失效：Taq DNA 聚合酶失活（反复冻融、保存温度不当）；dNTPs 降解或浓度不足；引物变质、降解或浓度过低。

反应体系配制错误：缓冲液缺少或浓度错误；Mg²⁺浓度不合适（Mg²⁺是 Taq 酶的激活剂，浓度过高 / 过低都会抑制扩增）；模板 DNA/RNA 加入量不足或未加入。

PCR 扩增参数设置错误：预变性时间不足，模板未完全解链；退火温度过高，引物无法与模板结合；延伸时间过短，扩增片段未完全合成；循环次数不足。

存在 PCR 抑制物：模板中残留蛋白、酚、氯仿、EDTA 等物质，抑制 Taq 酶活性。

排查方案

更换新的、保质期内的 Taq 酶、dNTPs 和引物重新配制体系，引物使用前可进行浓度验证。

核对反应体系配方，逐一检查各组分加样量，必要时重新配制混合母液，避免漏加或错加。

调整扩增参数：延长预变性时间至 5 min；根据引物 Tm 值降低退火温度 2–5℃ 尝试；按扩增片段长度调整延伸时间（1 kb/min）；增加循环次数 3–5 次。

重新提取模板，通过核酸定量仪检测纯度（DNA 的 A260/A280 比值应在 1.8 左右，RNA 应在 2.0 左右），确认无抑制物残留。

二、 非特异性条带过多（目的条带弱或不明显，杂带多）

可能原因

退火温度过低：引物与模板非特异性结合位点增多，引发非特异性扩增。

引物设计不合理：引物长度过短、GC 含量过高 / 过低、引物二聚体或发夹结构明显。

模板浓度过高：模板量过多导致引物与模板的非特异性结合概率增加。

Mg²⁺浓度过高：增强 Taq 酶活性的同时，也会提高非特异性扩增效率。

排查方案

梯度 PCR 优化退火温度：设置包含 Tm 值上下各 5℃的梯度，筛选最佳退火温度。

重新设计引物，确保引物长度在 18–25 bp，GC 含量 40%–60%，通过引物设计软件检测无明显二聚体和发夹结构。

对模板进行梯度稀释（如 10 倍、100 倍稀释），选择合适的模板浓度进行扩增。

降低 Mg²⁺浓度，设置 Mg²⁺梯度实验（1.0–3.0 mmol/L），确定最优浓度。

三、 扩增条带弥散（呈 “涂抹状”，无清晰条带）

可能原因

模板质量差：模板 DNA 降解严重，断裂成大量小片段。

酶浓度过高：Taq 酶过量会导致引物非特异性延伸，引发弥散。

循环次数过多：过度扩增导致非特异性产物大量累积。

电泳操作不当：凝胶浓度过低（不适合小片段分离）；电泳电压过高；上样量过多。

排查方案

重新提取高质量模板，提取后尽快进行 PCR 扩增，避免反复冻融导致模板降解。

减少 Taq 酶的加入量，遵循试剂说明书的推荐浓度。

减少 PCR 循环次数（一般控制在 25–35 次）。

调整电泳条件：根据片段长度选择合适浓度的琼脂糖凝胶（小片段用高浓度，大片段用低浓度）；降低电泳电压；减少上样量。

四、 扩增条带强弱异常（阳性对照正常，样本条带过弱 / 过强）

条带过弱

可能原因：模板浓度偏低；引物与模板匹配度不高；延伸时间不足；酶活性偏低。

排查方案：增加模板加入量；优化引物与模板的匹配性；延长延伸时间；更换活性正常的 Taq 酶。

条带过强且伴有弥散

可能原因：模板浓度过高；循环次数过多。

排查方案：稀释模板浓度；减少循环次数。

五、 阴性对照出现条带（污染问题）

可能原因

气溶胶污染：开盖离心管时液体飞溅，扩增产物扩散到实验环境。

耗材污染：使用的离心管、吸头未做无酶无 DNA 处理。

操作污染：移液器、实验台面未彻底消毒；各区耗材混用；实验人员手套污染后未及时更换。

排查方案

严格执行分区操作，扩增产物开盖在专用分析区进行；操作时动作轻柔，避免液体飞溅。

更换无酶无 DNA 污染的一次性耗材。

用 75% 乙醇或 DNA 酶清洁剂擦拭移液器和台面，紫外灯照射消毒；实验过程中及时更换污染的手套，各区移液器、耗材严格区分，严禁混用。