稳定表达细胞株构建-科学指南针

项目简介

向真核细胞中导入DNA主要有瞬时转染与稳定转染，统称为细胞转染。常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染。稳定转染是将重组DNA永久性的导入宿主细胞，此时的目的基因会整合进入宿主细胞染色体DNA中，并指导细胞中相应大蛋白的表达，同类型不同细胞会存在本底表达水平的差异，因此构建稳转细胞在表达效果上会略低于瞬转细胞，最终通过抗性筛选和指示标记可获得目的细胞，通常稳定转染细胞可反复使用，多用于后续动物等实验。平台可提供性价比高质量稳定的细胞株构建服务，并有专业的技术团队为您的需求定制相关细胞株或设计相关实验。

服务流程

技术路线

结果展示

结果展示

图1 293T细胞稳转株构建

载体选择

1 pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro载体图谱

载体名称	pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro
质粒类型	哺乳动物细胞慢病毒表达载体
高拷贝/低拷贝	高拷贝
启动子	CMV
克隆方法	多克隆位点，限制性内切酶
载体大小	8196 bp
载体抗性	氨苄
筛选标记	嘌呤霉素(Puromycin)、ZsGreen1
备注	载体能够同时表达ZsGreen1荧光蛋白、嘌呤霉素和目的基因。

2 pLVX-IRES-ZsGreen1质粒图谱

载体名称	pLVX-IRES-ZsGreen1
质粒类型	哺乳动物细胞慢病毒表达载体
高拷贝/低拷贝	高拷贝
启动子	CMV
克隆方法	多克隆位点，限制性内切酶
载体大小	8204 bp
载体抗性	氨苄
筛选标记	嘌呤霉素(Puromycin)
备注	载体能够同时表达ZsGreen1荧光蛋白和目的基因。

3 pLVX-shRNA2-Puro质粒图谱

载体名称	pLVX-shRNA2-Puro
质粒类型	RNAi载体
高拷贝/低拷贝	高拷贝
启动子	U6
克隆方法	多克隆位点，限制性内切酶
载体大小	8998 bp
载体抗性	氨苄
筛选标记	嘌呤霉素(Puromycin)
备注	载体能够同时表达ZsGreen1荧光蛋白和目的基因。

pLVX-shRNA2-Neo 载体图谱

载体名称	pLVX-shRNA2-Neo
质粒类型	慢病毒表达载体, RNAi载体
高拷贝/低拷贝	高拷贝
启动子	U6
克隆方法	多克隆位点，限制性内切酶
载体大小	9070 bp
载体抗性	氨苄
筛选标记	嘌呤霉素(Puromycin)
备注	载体能够同时表达ZsGreen1荧光蛋白和目的基因。

样品要求

收费标准

1.细胞费用（目的细胞）

①细胞使用费500/株细胞（我们平台现有细胞库里的细胞）；

②代购细胞，1.5-4K不等（到货周期会有影响）；

③客户提供细胞（冻干细胞2支，状态不佳会影响转染效果，支原体检测不收取费用）。

2.套餐费用（含试剂、细胞培养费用）

A套餐：载体构建

服务项目	收费
载体构建	500元
基因合成	1元/bp
菌液PCR	1000元

B套餐：载体构建+病毒包装

服务项目	收费
载体构建	3500元起
慢病毒包装	1000元
病毒滴度检测	750元
纯化病毒液	750元
293T细胞使用费	500元

C套餐：载体构建+病毒包装+稳定表达细胞株筛选

服务项目	收费
慢病毒包装	6500元
细胞株筛选	2000元
流式检测/抗性检测	2500元
WB检测	1000元
293T细胞使用费	500元

注：若基因＞2000bp，则需要额外收取基因合成费用，具体价格沟通后确定。

3.WB检测的抗体（客户提供）

交付结果（分为A、B、C三个套餐）

A套餐：基因合成报告、菌液PCR报告/双酶切检测报告、菌液（目的组）1mL、质粒（目的组）5μg。

B套餐：基因合成报告、菌液PCR报告/双酶切检测报告、滴度检测结果、支原体检测结果、纯化病毒液（空载组、目的组）各200μL。

C套餐：基因合成报告、菌液PCR报告、滴度检测结果、支原体检测结果、稳转株流式检测结果/抗性检测结果、WB检测结果(可选）、单克隆细胞结果、冻干细胞株-可选复苏细胞或者冻存细胞（空载组、目的组）各2支。

（不同套餐交付结果不同）

交付周期

测试周期为收到细胞后的6-8周左右，具体送样时间及实验周期请与工作人员沟通确认。

常见问题

1. 慢病毒包装的应用

慢病毒（lentivirus , LV）属于逆转录病毒科，该种病毒感染个体的潜伏期长达数年，之后缓慢发病，因此这些病原体被称为慢病毒。慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体，是目前细胞及模式生物实验中非常有效的工具，在基因转染方面有着许多独特的优势，对分裂细胞和非分裂细胞均能够有效感染，可容纳较大基因片段，同时能够将携带的基因稳定的整合到基因组中等优势，慢病毒包装逐渐成为科研必备的实验技能之一，多用于感染各种肿瘤细胞，建立稳定表达或沉默目的蛋白的细胞株。此外，我们还可以构建真核、原核表达载体；提供高滴度慢病毒液。

2. 如何选择合适的载体？

1.过表达载体

①根据启动子来选择载体：对于哺乳动物细胞来说，常见载体的泛表达启动子常见的基本包括CMV, SV40, EF1a, CAG。大部分都选择CMV、CAG或者EF1a其中之一即可，SV40表达能力稍弱。

②根据载体选择标记 (Selectable Markers) 来选择载体：载体的选择标记主要目的是区分表达于非表达目的基因的细胞。比较常用的选择标记有Puromycin、Blasticidin、 Neomycin、 Zeocin和各种荧光蛋白如ZsGreen、EGFP、 RFP mCherry等，我们一个基因通常只需选一种即可。

2.干扰载体

这类载体的选择要简单很多，启动子选择U6、CMV即可。但标记选择通常跟过表达类似，尽量选Puromycin和ZsGreen。

3. 为什么稳定细胞株构建周期长？

细胞株构建服务包括目的基因表达慢病毒载体构建、病毒包装、细胞转染、稳转细胞株筛选和细胞株鉴定等5个实验流程。其中慢病毒载体构建、病毒包装、细胞转染等步骤进展比较快，在稳转细胞株筛选及鉴定这步需要较长的时间，为了保证细胞株进行多次传代后，仍然保持其遗传稳定性，我们通过流式细胞仪或者抗性标记筛选出100-200个高水平表达克隆，并从中挑选最佳3-5个高产克隆细胞，这些克隆细胞在温暖的培养环境中慢慢地分裂成2个、4个、8个.....终于在10-15天的时候长成一个细胞团，这个时候为了保证克隆细胞的稳定性，技术人员将对该细胞团进行第二轮的亚克隆，甚至要进行第三轮亚克隆就能挑选出稳定表达的单克隆细胞。

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