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体外抗菌活性检测
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项目简介
简介
体外抗菌实验：体外条件下，测定细菌/真菌对测试样品的敏感程度。体外抗菌实验分为抑菌实验和杀菌实验，抑菌实验可测定仅有抑制细菌/真菌生长繁殖而无杀灭作用的测试样品；杀菌实验可测定不仅抑制而且能杀灭细菌/真菌的测试样品。
<1>抑菌实验方法有OD值法、抑菌圈法、共培养+平板涂布计数法（一般培养环境为细菌/真菌培养基）、MIC。
<2>杀菌实验方法有共培养+平板涂布计数法（一般培养环境为PBS/生理盐水溶液）、MBC。
一、抑菌圈测试
（1）实验原理
供试材料含可溶性抗菌成分，此成分在琼脂培养基中可自由扩散，形成一定浓度的含药区域。由于各种微生物对不同材料或同一材料不同浓度的敏感性不同，因而形成不同大小直径的抑菌圈。
（2）参考标准
GBT39101-2020-多肽抗菌性测定 抑菌圈法
NCCLS 药敏试验标准 纸片扩散法
（3）实验流程图
二、 OD值测试
（1）实验原理
细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成正比，通过OD值可以定性反映出微生物的浓度或数量。
不同材料按比例与菌液共培养一定时间后，通过比较不同组别（不同材料、不加材料）菌液OD值之间的大小来判断不同材料的抗菌性能。
（2）实验流程图
三、平板涂布计数测试
（1）实验原理
不同材料与菌液共培养一定时间后，不同组别（不同材料、不加材料）的菌液稀释一定倍数后涂布平板，以计算出不同组的菌液浓度。通过与对照组比较，进而计算出实验组菌液浓度下降百分比，即得到材料对测试菌株的抗菌性能。
（2）参考标准
GBT 31402-2015 塑料 塑料表面抗菌性能试验方法
JCT 1054-2007 镀膜抗菌玻璃
GBT 20944.3-2008 纺织品抗菌性能的评价 第3部分震荡法
GBT 21510-2008 纳米无机材料抗菌性能检测方法
GB/T 23763-2009 光催化抗菌材料及制品抗菌性能的评价
（3）实验流程图
四、MIC/MBC测试
（1）实验原理
将样品稀释成不同浓度（二倍稀释法），加入到微孔板/无菌试管中，在每个孔/试管中加入一定浓度的测试菌，培养一定时间后肉眼观察培养液的混浊情况，如果是澄清的，说明没有细菌的增长，即细菌的生长得到了抑制，培养液澄清的最小样品浓度为最小抑菌浓度，即MIC。
然后将澄清孔/管（3个样品浓度）取出涂布于培养基表面，若无细菌生长，则说明测试的菌已经被杀灭，此时的样品浓度为最小杀菌浓度，即MBC。
（2） 参考标准
YY/T 0688.1-2008临床实验室检测和体外诊断系统 感染病原体敏感性试验与抗菌剂敏感性试验设备的性能评价
GB/T27623.1-2011 渔用抗菌药物药效试验技术规范 第1部分:常量肉汤稀释法 药物敏感性试验
（3）实验流程图
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结果展示
1、抑菌圈测试结果
抑菌圈结果解读：
（1）抑菌圈测试一般用作样品抑菌性能的定性测试。若产生抑菌圈，则说明样品有一定的抗菌性。若无抑菌圈产生，说明该测试方法条件下样品无抗菌性。
（2）针对液体样本可能与浓度呈正相关，但并不意味着样本浓度越高，抑菌圈越大。因为测试样本对指定的测试菌株有一定的抑菌阈值，且抑菌性还与样本本身扩散性有关。
（3）取出培养完成的平板，采用十字交叉法，用游标卡尺测量抑菌圈（透明圈）直径（mm），以直径表示抑菌圈的大小。
抑菌圈直径（mm）=抑菌圈外径（mm）—样品直径/打孔孔径（mm）
2、OD值测试结果
|
分组 |
OD600 |
Average |
||||||||
|
1次平行 |
2次平行 |
3次平行 |
||||||||
|
control |
0.658 |
0.783 |
0.636 |
0.665 |
0.812 |
0.637 |
0.724 |
0.752 |
0.637 |
0.700 |
|
sample |
0.449 |
0.399 |
0.476 |
0.495 |
0.428 |
0.463 |
0.528 |
0.357 |
0.484 |
0.453 |
注：与对照组比较，**P＜0.01
OD值测试结果解读
（1）通过差异性分析，**P＜0.01代表实验组与对照组相比，有极显著性差异；*P＜0.05代表实验组与对照组相比，有显著性差异；P＞0.05代表实验组与对照组相比，无差异性。
（2）若OD600值实验组与对照组有极显著/显著性差异减小，则说明材料对测试菌株有抗菌性。
3、平板涂布计数测试结果
|
分组 |
菌落数 |
稀释倍数 |
菌液浓度（CFU/mL） |
抑菌率 |
|
对照 |
237 |
106 |
2.37×109 |
/ |
|
1 |
217 |
105 |
2.17×108 |
90.84% |
平板涂布测试结果解读：
（1）结果表格中菌落数为各组相应稀释倍数下的菌落计数结果，计数原则依据国家标准GB4789.2-2016，选取菌落数在30 CFU~300 CFU之间来进行菌落计数。在最小稀释倍数下，若仍无菌落生长，则证明样品抑菌效果非常明显。
（2）菌液浓度（CFU/mL）计算方式：菌落数×稀释倍数×10（0.1 mL稀释液涂布平板）
抑菌率=（1-实验组菌液浓度/对照组菌液浓度）×100%
4、MIC/MBC测试结果
MIC/MBC测试结果解读：
（1）MIC（最小抑菌浓度，Minimal inhibition concentration）判定标准：眼观无细菌生长的最低药物浓度确定为MIC。
（2）MBC（最小杀菌浓度，Minimum bactericidal concentration）判定标准：眼观清澈的孔/管摇匀, 吸取0.1 mL涂布于固体培养基，培养一定时间后计数，菌落数少于5个的最低稀释样品浓度确定为MBC。
样品要求
一、抑菌圈测试
（1）块体类—薄膜、布料、金属块、纸片、凝胶等
送样量：至少每种菌提供3个样品。
制样要求：金属块、凝胶类样本须制备成统一大小的圆形/方形，建议制备直径为6-10 mm圆形。布料、纸片类样本可代为裁剪，默认制备直径为6 mm。
<注：凝胶样本须保证样本在培养条件下（一般为37℃）不融化>
（2）液体类
送样量：根据测试时样本浓度而定：
①若采用原液测试，则样本量为1 mL/种菌；
②若采用稀释后样本测试，则须告知稀释倍数及稀释液，样本量为1 mL/稀释倍数/种菌。
（3）粉末类
送样量：因不同样本密度不同，无法保证每个加样孔均能加入等量样本，故建议样本做分散液，按照等体积加样(每个孔最大加样量为0.2 mL)，能提升样本量的一致性。需要提供质量/体积比（选择合适的样本分散液），样本量为质量/体积×1 mL/种菌。
<如果不可使用分散液，需要预试，样本量可联系本公司人员确认>
二、OD值测试
（1）块体类—薄膜、布料、金属块、纸片、凝胶等
送样量：需要提供样本与菌液的培养体系。比如X g样本/mL菌液，样本量为4X g/种菌。
（2）液体类（要求样本溶液无色或者淡色）
送样量：根据测试时样本的溶剂和浓度而定：
①若溶剂具备杀菌性（如DMSO、乙醇、甲醇、DMF等），推荐提供样本浓度为50倍测试浓度，样本量为0.1 mL/种菌。
举例：测试材料的溶剂为DMSO，测试浓度为2 mg/mL。则需提供样本为100 mg/mL浓度的样本0.1 mL/种菌。
②若溶剂不具备杀菌性（如PBS、纯水、生理盐水等），推荐提供样本浓度为10倍测试浓度，样本量为0.4 mL/种菌。
举例：测试材料的溶剂为纯水，测试浓度为2 mg/mL。则需提供样本为20 mg/mL浓度的样本0.4 mL/种菌。
<注：如果提供样本原液浓度高于推荐浓度，可按比例计算样本量>
（3）粉末类
送样量：需要提供样本与菌液的培养体系。比如X g样本/mL菌液，样本量为4X g/种菌。
三、平板涂布计数测试
（1）块体类—薄膜、金属块、镀膜玻璃等（具备一定的表面积）
测试方法参考国标GBT 31402-2015 塑料 塑料表面抗菌性能试验方（https://max.book118.com/html/2017/1123/141231780.shtm）、JCT 1054-2007 镀膜抗菌玻璃（https://www.antpedia.com/standard/5144389-1.html）
送样量：样本量为1个/次重复/种菌。
样本尺寸：标准尺寸大小5×5cm，建议最小尺寸1×1cm。
（2）液体类
送样量：根据测试时样本的溶剂和浓度而定：
①若溶剂具备杀菌性（如DMSO、乙醇、甲醇、DMF等），推荐提供样本浓度为50倍测试浓度，样本量为0.03 mL/次重复/种菌。
举例：测试材料的溶剂为DMSO，测试浓度为2 mg/mL。则需提供样本为100 mg/mL浓度的样本0.03 mL/次重复/种菌。
②若溶剂不具备杀菌性（如PBS、纯水、生理盐水等），推荐提供样本浓度为10倍测试浓度，样本量为0.1 mL/次重复/种菌。
举例：测试材料的溶剂为纯水，测试浓度为2 mg/mL。则需提供样本为20 mg/mL浓度的样本0.1 mL/次重复/种菌。
（3）粉末类
送样量：需要提供样本与菌液的培养体系。比如X g样本/mL菌液，样本量为X g/次重复/种菌。
四、MIC/MBC测试
（1）粉末/液体类（要求样本溶液，完全溶解且无色或者淡色）-微孔板法
送样量：根据测试时样本的溶剂和初始工作浓度而定：
①若溶剂具备杀菌性（如DMSO、乙醇、甲醇、DMF等），推荐提供样本浓度为50倍测试浓度，样本量为0.03 mL/种菌。
举例：测试材料的溶剂为DMSO，测试浓度为2 mg/mL。则需提供样本为100 mg/mL浓度的样本0.03 mL/种菌。
②若溶剂不具备杀菌性（如PBS、纯水、生理盐水等），推荐提供样本浓度为10倍测试浓度，样本量为0.1 mL/种菌。
举例：测试材料的溶剂为纯水，测试浓度为2 mg/mL。则需提供样本为20 mg/mL浓度的样本0.1 mL/种菌。
<注：如果提供样本原液浓度高于推荐浓度，可按比例计算样本量>
如果样本为粉末，可按照浓度和所需体积计算样本量（＜10 mg者，需称量并标记清楚，避免样本量较少情况下再反复称量造成损耗）。
（2）粉末/液体类（样本颜色较重）-平板法
送样量：根据测试时样本工作浓度和浓度个数而定。比如工作浓度为X g/mL（或µM），测试n个浓度，样本量为60X*n g（或10X µM的液体样本6*n mL）
（3）液体类（样本属于分散液或制备成分散液，且呈无色或者淡色）-试管法
送样量：根据测试时样本工作浓度而定
①若分散剂具备杀菌性（如DMSO、乙醇、甲醇、DMF等），推荐提供样本浓度为50倍测试浓度，样本量为2 mL/种菌。
举例：测试材料的分散剂为DMSO，测试浓度为2 mg/mL。则需提供样本为100 mg/mL浓度的样本2 mL/种菌。
②若分散剂不具备杀菌性（如PBS、纯水、生理盐水等），推荐提供样本浓度为10倍测试浓度，样本量为10 mL/种菌。
举例：测试材料的分散剂为纯水，测试浓度为2 mg/mL。则需提供样本为20 mg/mL浓度的样本10 mL/种菌。
（4）粉末类（直接加样）-试管法
送样量：根据测试时样本的工作浓度而定。比如工作浓度为X mg/mL（g/mL），则样品量为30X mg（g）/种菌。
常见问题
1. 抗菌活性可以测试哪些指标呢？该怎么选择呢？
1、OD值测试（适合无颜色干扰、可溶性样品）；
2、抑菌圈测试（适合活性成分可以溶出的样品）；
3、振荡培养+平板涂布计数法（可用于不溶性样品抗菌活性评价）；
4、MIC测试（适合已验证过具有抗菌活性且无颜色干扰的可溶性样品）；
5、MBC测试（适合已检测过具有最小抑菌浓度的样品）；
*如果之前没有做过抗菌实验，建议先做简单的抑菌圈或者OD值评估下抗菌效果。
2. 如何选择待测菌株？
3. 寄送样品量不足
如果寄送样品量不足，会造成反复寄样，影响您的实验周期。所以建议根据上述的《样品要求》准备样品量，若遇到样品量不太确定时，可与工作人员联系。
4. 灭菌方式如何选择？
灭菌方式的选择可参考下图建议，但紫外照射灭菌存在灭菌不彻底风险，尤其是粉末、棉布、多孔材料等样品。
5. 哪些实验需要提供工作浓度（即样品量/菌液量）？
OD值、共培养+平板涂布计数、MIC/MBC，这些测试必须提供工作浓度。
6. 对照设置问题
①抑菌圈测试，可选择以不加样品的菌落培养板为空白对照，可免费提供，或者若样品为纸片或者样品需要溶解，可提供滤纸片或者样品的溶剂作为空白对照，可免费提供。
②OD值测试，默认对照为不加样品的等量菌液；
③共培养+平板涂布计数测试中。a.常规抗菌实验：若样品是液体，平台可有偿提供不加样品的等量菌液为空白对照；若样品是固体，菌液加于固体样品表面看抑菌效果，平台可有偿提供将等量菌液直接加到平板或者孔板中的空白对照。b.黏附/抗黏附实验：与您材料的粘附性质有关，必须由您提供不加抗菌成分的对照样品作为空白对照。
④MIC/MBC测试，默认对照为添加等浓度的溶剂。
7. 抑菌实验与杀菌实验有何区别？
抑菌实验（默认）—测试样品对细菌是否具有抑制生长作用，测试时培养环境为培养基，即测试过程中细菌可以继续生长繁殖。
杀菌实验—测试样品对细菌是否具有杀灭作用，测试时培养环境为PBS/生理盐水，即测试过程中细菌不再生长繁殖。
8. MIC和MBC测试分为微孔板法、试管法、平板法，有哪些区别？
MIC和MBC测试分为微孔板法（微量肉汤稀释法）、试管法（常量肉汤稀释法）、平板法（琼脂稀释法）。
1. 微孔板法
方法：将样品用培养基/PBS/生理盐水稀释成不同浓度（二倍稀释法），加入100μL到微孔板中，在每个孔中加入等量一定浓度的测试菌液（100μL），培养一定时间后肉眼观察培养液的混浊情况。
结果判断：以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。选取1/2MIC浓度、MIC浓度、2×MIC浓度等浓度孔，各吸取100μL培养液涂布至固体培养基，培养一定时间后计数，菌落数少于5个的最低稀释样品浓度确定为MBC。
2. 试管法
方法：将样品用培养基/PBS/生理盐水稀释成不同浓度（二倍稀释法），加入一定量的样品溶液（0.5-1.5mL）到无菌试管中，在每个试管中加入与样品溶液等量的一定浓度测试菌液（0.5-1.5mL），培养一定时间后肉眼观察培养液的混浊情况。
结果判断：以肉眼观察，药物最低浓度试管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。选取1/2MIC浓度、MIC浓度、2×MIC浓度等浓度孔，各吸取100μL培养液涂布至固体培养基，培养一定时间后计数，菌落数少于5个的最低稀释样品浓度确定为MBC。
3. 平板法
方法：配置固体培养基，高温灭菌处理。待温度冷却降至一定温度（一般为50℃左右）时，将不同剂量的测试样品（一般为溶液）加入混匀，制成含不同递减浓度测试样品的平板。接种受试菌，孵育后观察平板上细菌的生长情况。
结果判断：将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以与对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度为MIC。完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MBC。
