【用户发刊】Chemical Engineering Journal：FT-ICR-MS揭示复合微生物菌剂通过群体感应提升厨余垃圾堆肥效率

首次系统阐明纤维素降解微生物通过群体感应（QS）信号分子（AHLs与AI-2）和QS相关基因调控堆肥中碳水化合物代谢的完整机制

该研究不仅量化了两种关键信号分子的含量变化（如C14-HSL、3-oxo-C6-HSL等），还通过方差分解分析（VPA）揭示了AHLs对QS功能基因变异的贡献率（37.31%）远高于AI-2（7.50%），并利用多元回归识别出关键调控基因（如rhlI、flhC、qseB），为理解微生物通讯与底物降解的耦合关系提供了分子层面的新见解。

揭示了复合微生物菌剂（CMI）相较于单一菌剂（如褐腐菌BRF或固氮纤维素降解菌CNFB）的协同增效机制。

研究发现，CMI能同时上调AHLs和AI-2两种信号分子，并协同激活flhD、kdpE、traR等关键基因，显著增强微生物运动性、生物膜形成及环境适应性。这种多靶点调控使CMI在促进能量代谢（如TCA循环贡献率33.95%）和糖代谢（如半乳糖代谢贡献率37.05%）方面效果远超单一菌剂，实现了堆肥过程的全面优化。

一、图1展示了不同堆肥处理中溶解性有机质（DOM）的分子组成变化。添加纤维素降解微生物可显著影响DOM的化学性质，促进堆肥腐殖化。

• (a)–(d)：为不同处理组的Van Krevelen图，直观展示了DOM分子组成在对照组（Ctrl）和三个接种处理组（G1、G2、G3）中的差异。

• (e)：显示不同处理下DOM按分子式类别的相对丰度变化。

• (f)：显示不同处理下DOM按化合物类别的相对丰度变化。

• (g)：为结构方程模型（SEM）分析，结果显示O/C、DBE和AI_mod之间呈显著正相关（P <0.05），进一步印证了纤维素降解微生物对DOM降解和芳香化的促进作用。

图 1：不同处理组DOM组成的Van Krevelen图（a）Ctrl组，（b）G1组，（c）G2组，（d）G3组；按分子式类别（e）和化合物类别（f）划分的DOM组成相对丰度；（g）分子组成与芳香族化合物之间的结构方程模型（SEM）分析。

二、纤维素分解微生物接种剂（尤其是复合菌剂CMI）显著增强了堆肥过程中细菌共现网络的规模、复杂性和稳定性。所有网络拓扑指标在各处理组中的排序基本一致（G3 > G1 > G2 > Ctrl），表明BRF和CNFB均能提升微生物群落的种间关联强度，而二者复合（CMI）通过协同效应产生了最为紧密、协调且高度模块化的群落结构。

图2：不同处理组细菌共现网络的拓扑特征：（a）节点数，（b）边数，（c）平均度，（d）网络密度，（e）聚类系数，（f）模块化系数。

三、图3主要展示了堆肥过程中细菌群落的变化及与碳水化合物代谢途径的关系。

• (a)：好氧菌丰度始终高于厌氧菌，与好氧堆肥环境一致。革兰氏阴性菌高温期下降（不耐热）、腐熟期回升，接种剂（尤其BRF和CMI）显著促进了其最终富集。耐胁迫菌丰度排序为G3 > G1 > G2 > Ctrl，表明接种剂增强了群落的环境耐受能力。

• (b)：堆肥初期各组样品聚集紧密（群落结构相似），随堆肥进行沿主坐标轴逐渐分离，说明接种剂引发了细菌群落的差异化演替，各处理最终形成各自独特的群落结构。

• (c)：Bacilli、Alpha-变形菌纲、Gamma-变形菌纲、拟杆菌纲和放线菌纲为五大优势菌纲（共占71.56%-99.68%）。Bacilli和Alpha-变形菌纲在高温期丰度最高、后期随降温下降；Gamma-变形菌纲、拟杆菌纲和放线菌纲则持续增加。堆肥末期接种剂组中Gamma-变形菌纲和拟杆菌纲丰度高于对照组，表明纤维素分解微生物加速了有机物降解。

• (d)：Bacilli与所有多样性指数（Shannon、Simpson、Chao1、Pielou、PD）均呈显著负相关，对群落多样性有抑制作用；Gamma-变形菌纲和拟杆菌纲呈显著正相关，是维持群落多样性和均匀度的主要贡献者；放线菌纲相关性较弱，影响有限。接种剂通过抑制Bacilli、促进后两类菌群来提升整体多样性。

图3：细菌群落变化与碳水化合物代谢通路丰度：（a）基于Bugbase预测的微生物不同表型丰度，（b）细菌群落主坐标分析（PCoA）图，（c）纲水平上细菌群落的相对丰度，（d）Alpha多样性指数与前五种优势菌之间的相关性分析。

四、纤维素分解微生物接种剂显著提升了堆肥中碳水化合物代谢通路的整体丰度。

• (a)：与初始阶段相比，所有处理组的碳水化合物代谢在堆肥第7至14天（高温期）显著增加，第28天因温度下降略有降低，第42天因腐殖质积累再次回升。堆肥结束时，所有接种微生物菌剂的处理组途径丰度均高于对照组，其中G3（复合菌剂）组的代谢途径丰度最高，尤其在能量代谢（如丙酮酸代谢、TCA循环）和有机物代谢（如淀粉和蔗糖代谢、磷酸戊糖途径、糖酵解）方面表现突出。

• (b)：接种剂处理组中花青素类化合物含量升高（CMI同时增加黄酮类），有助于增强微生物抗逆性并抑制病原菌增殖。含氮化合物在接种组中比例更高，与图1中CHON类物质增加的结论一致。

• (c)：接种剂促进了酰胺反应（三组均有）、羧酸反应（CMI最强）和美拉德反应（BRF最强）。这三类反应均为腐殖质前体形成的关键路径，其中美拉德反应对芳香族和含氮腐殖前体的生成尤为关键。

• (d)：CBMs、GHs和GTs在接种组中丰度均高于对照组。BRF在GTs上调方面强于CNFB，CMI在三类酶上均达最高水平，其中GTs较对照组增加16.39%-23.36%。GTs直接参与腐殖质前体合成，其丰度升高进一步支撑了CMI促进腐殖化的结论。

图4：不同处理组细菌共现网络的拓扑特征：（a）不同碳水化合物代谢通路的相对丰度（丰度经log10转换以利于数据归一化和分析），（b）潜在反应物的相对含量，（c）潜在反应类型的相对数量，（d）堆肥后不同处理组CAZymes的丰度。

五、RF主要驱动AHLs信号通路，CNFB主要驱动AI-2信号通路，CMI协同增强两者。基因富集分析显示三组各自激活了不同的功能基因集，其中CMI上调的基因种类最多、覆盖信号合成、运动调控、生物膜形成等多个功能类别，这些基因丰度的提升进一步证实了接种剂通过增强微生物群体通信来加速堆肥过程。

(a)：从基因层面确认了BRF偏向AHLs、CNFB偏向AI-2的路径差异。AHLs相关基因在BRF组中丰度最高，AI-2相关基因在CNFB组中丰度最高，而CMI组两类基因均达到最高水平，说明复合菌剂同时激活了两种信号分子的合成。

(b)： 143个QS相关基因在接种剂组中的丰度均高于对照组，排序为G3 > G1 > G2 > Ctrl，说明QS系统的整体活跃度被接种剂提升，其中CMI效果最显著。

(c–e)：火山图展示了各处理组相对于对照组被显著激活的特定QS基因。BRF组富集了_lacD_（乳糖代谢）、rhlI（信号分子合成）、mexH/I（耐药性）等基因，体现其对代谢调控和胁迫响应的增强。CNFB组以_rhlI_基因上调为主要变化。CMI组富集基因种类最多，包括_flhC_（调控细菌运动）、qseB（双组分系统调控）、rpfC/G（参与生物膜形成与信号转导）、phzE（合成抗性化合物），说明CMI对QS系统的调控覆盖范围最广，从信号产生、信号感知到下游功能响应均有涉及。

图5：堆肥过程中群体感应基因的变化：（a）不同信号分子基因的丰度（丰度经log10转换以利于数据归一化和分析），（b）群体感应基因的丰度（丰度经log10转换以利于数据归一化和分析）；（c-e）群体感应基因富集分析的火山图（以Ctrl组为对照），（c）Ctrl与G1之间显著差异的QS基因，（d）Ctrl与G2之间显著差异的QS基因，（e）Ctrl与G3之间显著差异的QS基因。

六、AHLs对QS功能基因变异的解释率（37.31%）远高于AI-2（7.50%），确认AHLs为QS主导信号。Mantel检验证实QS基因丰度与大部分碳水代谢通路呈显著正相关。多元回归量化显示_rhlI_贡献最大（8.09%-19.22%），CMI对能量代谢（TCA循环33.95%）和有机质降解（半乳糖代谢37.05%）的贡献率均最高。

• (a)： AHLs相关基因单独解释QS功能基因变异的37.31%，AI-2仅解释7.50%，证实AHLs是QS主导信号，解释了BRF调控强于CNFB的原因。

• (b)：QS功能基因丰度与大部分碳水代谢通路呈显著正相关，且各代谢通路之间也相互促进，建立了QS调控碳水代谢的因果关联。

• (c)：9个上调QS基因中_rhlI_贡献最大（8.09%-19.22%），其次为_flhC_、qseB、rpfG。CMI对能量代谢（TCA循环33.95%、丙酮酸代谢26.74%）和有机质降解（半乳糖代谢37.05%、磷酸戊糖途径25.80%）的贡献率均高于G1和G2，证实CMI通过协同激活多条QS通路实现对碳水代谢的最强促进。

图6：（a）方差分解分析（VPA），（b）Mantel检验，（c）显著上调的QS基因对碳水化合物代谢的贡献及其相关性分析。

七、图7展示了添加纤维素分解微生物后，堆肥过程中不同群体感应（QS）机制对碳水化合物代谢的调控路径。具体而言，单独添加BRF主要通过诱导AHLs信号分子来调控代谢；单独添加CNFB则依赖AI-2信号；而复合微生物菌剂（CMI）能协同增强AHLs和AI-2两种信号，从而更有效地刺激群体感应活性，加速有机物降解与堆肥熟化

图7：添加纤维素分解微生物后堆肥中调控碳水化合物代谢的不同群体感应机制

本研究表明，三种纤维素分解微生物接种剂——褐腐菌BRF、固氮菌CNFB及二者复合菌剂CMI——均能显著提升厨余垃圾堆肥过程中木质纤维素的降解效率，其中BRF在促进纤维素和半纤维素降解方面的效果优于CNFB，而CMI通过两类菌株的协同作用表现最佳。在分子层面，接种剂显著提高了木质纤维素降解酶活性，并通过FT-ICR-MS分析证实它们改变了溶解性有机物的分子组成，使芳香族化合物和含氮化合物比例上升，同时激活了酰胺反应、美拉德反应和羧酸反应，为腐殖质前体的形成提供了关键中间产物。微生物群落分析表明，接种剂提高了细菌群落的Alpha多样性和共现网络复杂度，并富集了以Gamma-变形菌纲和拟杆菌纲为代表的降解功能菌群。在群体感应机制方面，褐腐菌主要通过AHLs通路发挥调控作用，而固氮菌以AI-2信号为主，复合菌剂则同时增强了AHLs和AI-2两类信号分子的丰度及相应功能基因的表达，其中方差分解分析显示AHLs对群体感应功能基因变异的解释率达到37.31%，远高于AI-2的7.50%，表明AHLs是该系统中的主导信号路径。基因富集分析进一步鉴定出关键上调基因，多元回归分析量化了这些基因对淀粉蔗糖代谢、糖酵解、三羧酸循环等碳水化合物代谢通路的显著贡献。此外，接种剂还促进了花青素和黄酮类次生代谢物的积累，增强了微生物对环境胁迫的耐受性，并使成熟堆肥中含氮化合物比例升高。总体而言，BRF和CNFB通过两种不同的群体感应信号路径分别调控碳水化合物代谢，而CMI通过同时激活两条信号通路产生协同增强效应，这为优化有机固废资源化利用提供了基于群体感应调控的新策略。