核酸及核苷酸色谱分析-2

离子对HPLC同时测定细胞提取液的核苷酸、脱氧核苷酸、烟酰辅酶、羟基嘌呤、核苷及其碱

(1) 色谱条件色谱柱:Alltima C18柱(250 × 4.6mm,5pm)。预柱;Alltima Ci,柱。流动相:A．缓冲液（10mmol/L氢氧化四丁铵，10mmol/L磷酸二氢钾)-甲醇(97.75:0.25)(用盐酸调至pH7);B.甲醇液(含2.8mmol/L氢氧化四丁铵30%,用盐酸调至pH5.50),两液均须新鲜配制。梯度:0~15min,100%A; 15~20min，100%~90%A;20~一25min，90%~70%A;25一40nin，70%~63%A;40~55min，63%~55%A; 55~～75min,55%一45%A; 75~85min, 45%～25%A;85~95min,25%~0%A。流速:1.5min/ml。柱温:21℃。检测:二极管阵列检测器,扫描范围200~300nm，测定波长267nm。

(2) 样品测定﹐取健康自愿者淋巴细胞,立即分离,在显微镜下用锥虫兰排斥法仔细观察细胞的活力和数量,用经冰冷却的补充葡萄糖的PBS液洗三次,用1.2mol/L高氯酸脱蛋白,4℃下离心10min(13000r /min),上清液加入等体积色谱纯三氯甲烷,涡旋混合60s ,离心3min(13000r/min),经三氯甲烷提取的上清液再在4℃下离心3min(13000r/min)后浸入液氮90s,用0.45pm HV-Millipore滤膜滤过。取滤液200ul进样。保留时间;1.5~95min内出峰顺序为胞嗜啶(Cyt)、尿密啶（Ura)、次黄嘌呤(Hyp)、鸟嘌呤(Gua)、黄挛呤(Xan)、胸腺嚰啶（Tyh)、肌苷（Ino)、腺嘌呤(Ade)、尿酸（Uricacid)、胞喀啶核苷酸(CMP)、尿密啶核苷酸（UMP)、腺苷(Ado)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、肌苷酸（IMP)、鸟嘌呤核苷酸(GMP)、胸腺密啶脱氧核苷酸(dTMP),腺嘌呤核苷酸(AMP)、胞苷二磷酸(CDP)、脱氧胞苷二磷酸(dCDP)、尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)、脱氧尿苷二磷酸(dUDP)、三磷酸吡啶(NADP)、核糖核苷二磷酸（ADPrib)、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)、脱氧腺苷二磷酸(dTDP)、胞苷三磷酸(CTP)、腺苷三磷酸(ATP)、腺苷二磷酸(ADP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、尿背三磷酸（UTP)、鸟苷三磷酸(GTP)、脱氧腺苷磷酸（cAMP)、脱氧尿苷三磷酸(dUTP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧鸟苷二磷酸（dGDP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、三磷酸腺苷(ATP)、脱氧三磷酸腺苷(dATP).

(3) 方法准确度和精密度RSD: 0.78%。(n=10).

(4）线性范围和检测限检测限:CTP碱，8pmol; dGTP，100pmol.

【1】张祥民. 现代色谱分析[M]. 复旦大学出版社, 2004.

【2】傅若农, 顾峻岭. 近代色谱分析[M]. 国防工业出版社, 1998.

【3】刘克玲. 实用仪器分析[J]. 国外科技新书评介, 2014(8):1.

【4】李发美. 医药高效液相色谱技术[M]. 人民卫生出版社, 2000.

【5】严拯宇. 中药薄层色谱分析技术与应用[J]. 中国医药科技出版社, 2009.

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