【摘要】 实验过程中现将样品制备好，将立体纤毛分离后立即对网格进行深度冷冻，内耳剥离后尽快冷冻。

内耳毛细胞立体纤毛的高分辨率成像对理解听觉和前庭功能有很大贡献。为了提供立体纤毛细胞骨架和膜结构的三维视图，Zoltan Metlagel等人[1]开发了一种在电子显微镜网格上快速冷冻未固定立体纤毛的方法，该方法允许随后通过电子冷冻断层扫描进行3D成像。

 

实验过程中现将样品制备好，将立体纤毛分离后立即对网格进行深度冷冻，内耳剥离后尽快冷冻。尽管大多数插入都是在自制的手动柱塞上完成的，但Vitrobot（ThermoFisher Scientific）也获得了类似的成功。当在Vitrobot中进行浸渍时，湿度设置为70%，并且在装载格栅之前允许腔室平衡20-30秒。在大部分解剖过程中，室门保持打开，加湿器关闭，以防止滤纸变湿并失去吸走溶液的能力。然后将网格存储在液氮下直到在电子显微镜中成像。

 

使用玻璃化样品，实验过程中收集了年轻成年小鼠胞囊的单轴断层倾斜系列和成年牛蛙囊状体纤毛。小鼠胞囊样品包括从质体1敲除突变体（Pls1-/-）中分离的样品，与WT胞囊相比，其立体纤毛中具有六边形堆积的肌动蛋白丝（Krey等人，2016）。

 

WT和Pls1-/-小鼠立体纤毛和青蛙立体纤毛显示了零度倾斜的低剂量投影图像。通过相应三维重建的中心截面显示为纵向和横截面方向，位置由两条黑色平行线指示。立体纤毛尖端、轴和锥的结构被揭示，表明肌动蛋白副晶体不是完全有序的。

 

这种样品制备和成像程序将允许检查近天然状态下的立体纤毛的结构特征。

 

[1]Metlagel, ZoltanKrey, Jocelyn F.Song, JunhaSwift, Mark F.Tivol, William J.Dumont, Rachel A.Thai, JasmineChang, AlexSeifikar, HeliaVolkmann, NielsHanein, DoritBarr-Gillespie, Peter G.Auer, Manfred.Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia[J].Journal of Structural Biology, 2019, 206(2).

 

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