植物低温扫描电子显微镜成像技术

许多研究问题需要研究植物形态，特别是细胞和组织，尽可能接近它们的原始环境，并且没有一些预备化学试剂或样品干燥造成的物理变形。冷冻扫描电子显微镜(cryoSEM)涉及在超低温下快速冷冻和维护样品，以便通过扫描电子束进行详细的表面成像。这些数据对于探索组织/细胞形态发生非常有用，再加上一个额外的低温断裂/低温刨削/铣削步骤，可以获得有关空气和水空间以及亚细胞超微结构的信息。Raymond Wightman^[1]概述了从样品制备到成像的过程，并详细说明了如何将其应用于植物研究的不同领域，讨论了该技术未来的发展方向和改进措施。

扫描电子显微镜(SEM)是一种跨学科的工具，以各种方式表征硬材料和软材料。根据探测器的配置，扫描电镜可以获得有关表面拓扑结构、粗糙度、形貌、成分差异以及有时是次表面特征的信息。对于生物学应用，这转化为关于组织组织的信息，构成这些组织的细胞轮廓，这些细胞的表面轮廓和亚细胞特征的识别。扫描电子束需要真空或部分真空，这取决于成像水平，因此，样品可能需要在这种环境中保持稳定。对于植物标本，作为生物材料的一种形式，这可能需要事先进行一些准备。可能需要更好地保持整体结构的可控脱水。对于一些样品，新鲜收获的组织可以直接安装在扫描电镜内，无需事先处理，并在变压(VP)或扩展压力(EP)模式下保持稳定，依赖于低真空和有时潮湿的环境。

图1 (A)VP-SEM、(B)EP-SEM和(C)低温扫描对含茎顶端分生组织的拟南芥顶端进行了比较。^[1]

低真空扫描电镜成像，重点是VP-SEM。对于应用于植物的VP-SEM成像，Talbot和White优化了用于叶表皮细胞成像的VP-SEM参数。在VP模式下，使用背散射电子探测器可以很容易地识别细胞轮廓，其中新鲜和水合的叶子样品通过中等低温阶段稳定。较低的温度减少了叶片样品的水分损失，提供了20分钟的有用成像时间。使用VP-SEM观察叶表皮细胞形态无需对样品进行任何处理。

低温扫描电子显微镜包括在低温下制备和维护新鲜的水合材料。冷冻材料适合在高真空条件下成像。它需要用于冷冻、破裂、升华、涂层和转移到扫描电子显微镜小室的处理和附加设备，以及小室内的冷冻台，以在成像过程中保持样品的冷冻。从采集植物样本到在低温条件下拍摄第一张图像的时间约为25分钟，需要培训和练习才能成功执行工作流程。在要求的低温下获得系统大约需要额外的1小时。这比在VP-SEM中成像更长，需要更多的精力，但低温扫描并不比优化EP-SEM的湿成像更费力。图1显示了VP-SEM、EP-SEM和低温扫描电子显微镜对解剖的拟南芥茎尖的比较，这是一种对损伤和干燥非常敏感的具有挑战性的样本。对于这种类型的样品，只有EP模式和冷冻模式保留了器官和组织水平的形态。

低温工作流程可以概括为(一)安装样品并在存根上以正确的方向放置。通常情况下，样品被安装在最佳切割温度化合物上，由黄铜制成的存根。(二)样品的快速冷冻。(三)在真空或惰性气体下转移到扫描电镜室，可选择的步骤是低温断裂或低温超低温切片，升华和导电涂层。(四)在真空中保持低温环境，防止水分流失，防止外源结冰。

图2. 低温制备方案的主要步骤。^[1]

基于低温扫描电子显微镜的技术对于探索共生真菌与植物根系之间的相互作用，特别是组成丛枝菌根的丛枝形成真菌之间的相互作用是非常宝贵的。定植的根部样本在液态中深度冷冻，然后冷冻以获得平坦的成像表面或断裂以获得粗糙表面。然后，将冻结的平坦或破碎的根皮质细胞表面升华。这一升华步骤是确定细胞间菌丝和细胞内丛枝的不同分枝和成熟程度的关键。

未来的技术改进可能涉及冷冻准备硬件，例如在冷冻和转移过程中最大限度地减少人工操作，以及压裂或磨铣技术的进步。改进可以进一步涉及扫描电镜腔内的成像。更高的放大倍率和分辨率较小的特征将需要从近玻璃化过渡到玻璃化。对于植物研究，样品类型通常很大，特别是与冷冻透射电镜的普通薄膜和薄片相比，在样品大小和可实现的保存之间总是存在权衡。

[1] Wightman, R. An Overview of Cryo-Scanning Electron Microscopy Techniques for Plant Imaging. Plants 2022, 11, 1113.

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