【摘要】 纳米技术的最新进展，特别是原子力显微镜（AFM），为研究微生物学中的单细胞和单分子提供了新的机会。

微生物细胞壁具有多种重要功能，如决定和维持细胞形状、保护细胞免受不利环境的影响、介导宿主相互作用和生物膜形成以及调节免疫反应。尽管微生物细胞壁成分的结构和生物化学组成通常具有良好的特征，但对单个成分的空间组织、组装、构象特性和相互作用知之甚少。这在很大程度上是因为微生物学中的传统方法侧重于细胞或分子的大集合，而不是单个细胞和单个分子。

 

事实上，众所周知，单个微生物细胞在基因组成、生理学、生物化学和行为方面可能存在很大差异，这种变异性或异质性可能对各种过程产生重要影响，如抗生素耐药性、发酵生产力、食品防腐剂的功效以及病原体致病的可能性。越来越多的证据表明，单个细胞可以表现出异质性的极性组织。

 

纳米技术的最新进展，特别是原子力显微镜（AFM），为研究微生物学中的单细胞和单分子提供了新的机会。AFM可以在缓冲溶液中直接以纳米分辨率对膜蛋白和活细胞进行成像，这是电子显微镜技术的一个关键优势。特别地，单细胞的实时成像提供了对动态结构事件的新见解，例如由生长或药物相互作用引起的结构变化。

 

除了结构成像，力谱模式（BOX1）越来越多地被用于测量细胞的纳米级化学和物理性质。化学力显微镜（CFM）用特定的官能团修饰AFM尖端，为绘制细胞表面的化学基团并测量它们的相互作用提供了一种方法。单分子力谱（SMFS）现在被常规用于探测膜蛋白的展开途径、细胞表面聚合物的构象特性和表面受体的定位。

 

显微镜一直是微生物学的重要工具。光学显微镜可用于计数和鉴定细胞，以及确定其一般形状，但分辨率仅限于光的波长。电子显微镜技术可以提供细胞的高分辨率图像28，29。尽管这些方法很强大，但要求很高，需要真空条件，这意味着不能在水溶液中研究活细胞。在过去的几年里，在将AFM成像应用于单细胞从而补充电子显微镜获得的数据方面取得了快速进展。

 

最近被成像的微生物包括大肠杆菌、芽孢杆菌、梭菌33、牛分枝杆菌、黄粘球菌以及几种真菌和硅藻。Plomp和Ma等人[1,2]研究表明，AFM可以与电子显微镜相结合，以获得细胞表面的全面视图。Cross和Dague等人[3,4]指出最近一个越来越受到关注并有望研究细胞功能的趋势是使用AFM成像来评估细胞壁组成改变的突变菌株的表型特征。例如，比较人类真菌病原体烟曲霉的野生型和突变分生孢子（图1）。

 

AFM在野生型和∆rodB突变体上显示了10nm宽的小杆状物，但在具有颗粒表面的∆rodA和∆rodA∆rodB突变体上没有这些结构。这提供了直接的证据，证明小棒的形成只需要A棒。与AFM数据一致，X射线光电子能谱和二次离子质谱证实，野生型分生孢子表面富含蛋白质，含有大量疏水性氨基酸，而没有杆状物的突变体表面富含多糖。

 

图1 |活细胞成像：a–d|水溶液中的原子力显微镜地形图像，揭示了烟曲霉野生型和突变分生孢子表面的主要结构差异

 

实时成像为探测动态事件提供了新的机会，例如与生长和分裂相关的细胞壁重塑。单个发芽的萎缩芽孢杆菌孢子的结构动力学的一系列高分辨率图像提供了这种方法的一个例子（图2）。

 

AFM揭示了先前未被识别的发芽诱导的孢子外壳结构的改变，以及外部孢子外壳杆状结构的分解。新兴生殖细胞的新生表面被揭示为肽聚糖纤维的多孔网络，类似于NMR检测到的肽聚糖低聚物的蜂窝结构。

 

在一项相关研究中，超薄切片透射电子显微镜和AFM的联合使用提供了关于新梭菌NT33休眠孢子和发芽孢子结构的详细信息。孢子被一个无定形层包围，该无定形层与蜂窝状的孢子旁层交织在一起。

 

图2 天然条件下发芽的单一萎缩芽孢杆菌孢子结构动力学的实时成像

 

[1] Plomp, M. et al. Spore coat architecture of Clostridium novyi NT spores. J. Bacteriol. 189, 6457–6468 (2007).

[2] Ma, H., Snook, L. A., Tian, C., Kaminskyj, S. G. W. & Dahms, T. E. S. Fungal surface remodelling visualized by atomic force microscopy. Mycol. Res. 110, 879–886 (2006).

[3] Cross, S. E. et al. Atomic force microscopy study of the structure–function relationships of the biofilm-forming bacterium Streptococcus mutans. Nanotechnology 17, S1–S7 (2006).

[4] Dague, E., Delcorte, A., Latgé, J. P. & Dufrêne, Y. F. Combined use of atomic force microscopy, X-ray photoelectron spectroscopy, and secondary ion mass spectrometry for cell surface analysis. Langmuir 24, 2955–2959 (2008).

 

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