【摘要】 质谱法（MS）是检测和定量DNA损伤最敏感、最特异的方法，也是鉴定活性基因毒素形成的新加合物结构的宝贵工具由于各种原因，在生物样品中检测和量化DNA ICLs具有挑战性。

基因组不断暴露于各种内源性和外源性DNA修饰剂，其中一些具有两个反应基团（即双功能剂）。除了产生单加合物外，这些双功能试剂还可以与DNA形成第二键，从而形成交联有两种类型的DNA交联:那些在同一DNA链内的（链内交联）和那些在DNA螺旋的相反立场之间的（链间交联，ICLs）。DNA ICLs是毒性最大的DNA损伤之一，因为它们阻止了两条DNA链的分离，而这是转录和复制的先决条件1。

 

因此，ICLs对基本的细胞过程起着绝对的阻碍作用，对快速分裂的细胞尤其有害。这导致了交联剂的广泛使用，如氮芥菜、顺铂、丝裂霉素C和补骨脂素，作为有效的抗癌疗法除了形成ICLs的治疗药物外，其他外源的ICL包括环境污染物，如燃料燃烧产生的1,3-丁二烯脂质过氧化副产物（包括丙二醛和巴豆醛）产生的ICL也有内源性来源，其浓度也受到外源性因素的强烈影响，例如摄入膳食脂质和酒精，以及接触烟草烟雾和汽车尾气。另一种内源性诱导ICLs的物质是一氧化氮，一种对血管调节很重要的信号分子。

 

除了药物桥接的ICLs外，最近在双链DNA中发现了一类新的ICLs，这些icl是由无嘌呤/无嘧啶（AP）位点（也称为碱基位点）与相反链上的核碱基反应产生的AP位点是DNA中n -糖苷键自发或酶催化水解引起的常见DNA损伤，它们以开环醛（C1 '位置）和闭环半缩之间的平衡存在开环醛能够通过与相反链上腺嘌呤（Ade）或鸟嘌呤（Gua）残基的外环氨基反应形成icl。AP位点也可以从2-脱氧核糖片段的氧化中获得（例如，C4 ' -或C5 ' -氧化的AP位点），并已被证明在双工DNA中产生ICLs。

 

质谱法（MS）是检测和定量DNA损伤最敏感、最特异的方法，也是鉴定活性基因毒素形成的新加合物结构的宝贵工具由于各种原因，在生物样品中检测和量化DNA ICLs具有挑战性。除了相对罕见外，与其他类型的病变相比，许多由烷基化剂（如氮芥和亚硝基源）诱导的ICLs （例如，由Gua的N7位置和Ade的N7/N3位置的烷基化形成）具有水解不稳定性，导致自发去纯化。自发水解可以在细胞储存、DNA提取和酶解过程中发生，并导致ICLs中交联核碱基的丢失虽然MS先前已被应用于测量化疗诱导的ICLs和来自环境污染物的ICLs，但它尚未被应用于检测内源性细胞过程产生的DNA交联，尤其是由于这些交联的身份难以捉摸。

 

此外，由于技术限制，大多数基于MS的ICL测量方法采用靶向方法，旨在测定由特定暴露（如癌症化疗药物）形成的单个或几个特定ICL。文献中从未报道过类似于DNA内收切开术的DNA ICLs的全面的、非靶向的分析在该研究中，Hu等人2开发了一种高分辨率，准确的质谱方法来全面测量生物样品中的DNA ICLs （即预期和意外），创造了术语“DNA交联组学”来描述这种方法。执行交联组学的策略如图1所示。

 

该实验的关键步骤是基于所使用的DNA水解酶可以释放ICLs和链内交联，分别作为修饰的二核苷和二核苷磷酸。考虑到ICLs由两个2-脱氧核糖（dR）组成，并且2 ' -脱氧核苷糖苷键在正电离过程中非常不稳定，DNA交联组学方法的一个关键新特征是监测一个dR组（116.0474 amu）和两个dR组（232.0948 amu）的准确质量中性损失。

图1DNA交联学方法的基本概念。外源和内源（如甲醛和烷基化化疗药物）均可诱导DNA ICLs和链内交联。

 

由于链内交联得到的修饰的二核苷磷酸在正离子模式下不易质子化，因此它们不会干扰使用策略1的ICLs测量。此外，一些嘌呤核苷在某些核碱基位置修饰（例如两个Gua-N7位置之间的交联）是不稳定的，在样品制备过程中可能会自发去嘌呤化，从而形成二核碱基加合物（核碱基交联）。

 

为了解决这个问题，DNA交联组学方法的另一个新特点是通过监测一个核碱基以及任意两个核碱基的中性损失来检测核碱基交联（例如，两个Gua碱基损失302.0988 amu，一个Gua和一个Ade核碱基损失286.1038 amu），其中交联修饰带正电（图2）。因为ICLs和链内交联都是由二核碱基组成的（除了AP位点相关的DNA交联），策略II无法区分链间交联和链内交联。图1所示。DNA交联学方法的基本概念。

图2 利用LC-HRMS和DD-NL-MS3扫描模式检测DNA交联作为修饰二核苷（A，策略I）或作为修饰二核碱基（B，策略II）的策略。

 

外源和内源（如甲醛和烷基化化疗药物）均可诱导DNA ICLs和链内交联。在提出的DNA交联组学方法中，DNA样品被分离并酶解以选择性地释放ICLs （作为修饰的二核苷）和链内交联（作为修饰的二核苷磷酸）。在样品制备过程中，一些嘌呤核苷在某些核碱基位置被修饰，不稳定，可能发生自发去嘌呤化，从而形成核碱基交联。该研究旨在全面测量ICLs和核碱基交联。

 

通过筛选小牛胸腺DNA （CT-DNA）中甲醛和烷基化化疗药物氯苯（CLB）诱导的DNA交联，成功验证了本方法的有效性。在甲醛处理中，不仅检测到五种已知的DNA ICLs，还检测到两种意想不到的DNA。在CLB的情况下，检测到两个已知的DNA ICLs，以及八个意想不到的新DNA ICLs，说明了交联组学方法的强度。

 

1.Stone, M. P.;  Cho, Y.-J.;  Huang, H.;  Kim, H.-Y.;  Kozekov, I. D.;  Kozekova, A.;  Wang, H.;  Minko, I. G.;  Lloyd, R. S.;  Harris, T. M.; Rizzo, C. J., Interstrand DNA Cross-Links Induced by α,β-Unsaturated Aldehydes Derived from Lipid Peroxidation and Environmental Sources. Acc. Chem. Res. 2008, 41 （7）, 793-804.

2.Hu, C.-W.;  Chang, Y.-J.;  Cooke, M. S.; Chao, M.-R., DNA Crosslinkomics: A Tool for the Comprehensive Assessment of Interstrand Crosslinks Using High Resolution Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2019, 91 （23）, 15193-15203.

 

科学指南针已获得检验检测机构资质认定证书（CMA）、实验动物使用许可证、“ISO三体系认证”等专业认证，提供材料测试、高端测试、环境检测、生物服务、模拟计算、科研绘图、数据分析、试剂耗材、行业解决方案、指南针学院等多项科研产品和服务矩阵。企业致力于为高校、科研院所、医院、研发型企业等科研工作者，提供专业、快捷、全方位的检测及科研服务。

 

免责声明：部分文章整合自网络，因内容庞杂无法联系到全部作者，如有侵权，请联系删除，我们会在第一时间予以答复，万分感谢。