生物组织的X射线荧光显微镜方法

构建生物标本中的元素分布图可以提供对正常功能期间细胞和生物体的结构和功能方面的新见解，揭示新陈代谢或细胞形态对刺激或治疗的变化，或提供疾病状态下功能障碍的重要线索。这种类型的分析提供了额外的维度来帮助标本的角色塑造，这不仅限于绘制多种元素的分布图，而且还包括原位元素的量化以及化学形态形成的可能性。

基于同步加速器的X射线荧光光谱仪显微镜(XFM)是一种功能强大的多功能工具，用于实现这种多维角色塑造，同时为许多元素提供定量数据。在足够高的能量下，入射X射线束与样品的相互作用将激发存在的元素的显著横截面，促使它们进入激发态。衰变回到基态会产生X射线荧光光子的发射，从而允许探测。

XFM可以通过检测发射的X射线荧光光谱仪信号，提供样品中元素的分布及其浓度的信息。虽然XFM不能区分元素的化学形式，也不能区分元素的同位素，但是可以通过在元素图中的点(像素)获取X射线吸收光谱数据(称为μXAS)或执行化学特异性成像(CSI)来鉴定特定的化学物质。

绘制生物样品中元素分布图的能力提供了机会，使我们能够对生物系统的结构和功能组成部分有新的认识，并发现新的和意想不到的细节。这些例子包括昆虫切割器具中的金属和卤素角色塑造，组织和细胞中的代谢差异，这些在组织学上可能并不明显，植物中重元素的定量摄取和分布，特定细胞周期阶段中意想不到的元素分布，对涉及重金属生理反应的潜在化学过程的化学见解，以及对神经退行性疾病的新见解

在过去的一个世纪中，同步加速器研究已经成为科学研究和发现的多个核心领域的主流，包括物理学、化学和生物化学结构测定、药物发现、生物医学成像、地质学和工程学。在过去的50年里，基于同步加速器的元素探测和生物样品的角色塑造迅速增长，许多同步加速器设备现在都有专门的光束线，用于优化XFM。

基于同步加速器的XFM的一般要求是具有稳定位置的单色光束，能够通过光束路径再现光栅扫描样品，以及能够检测样品发出的X射线荧光光谱仪。在实践中，同步加速器设施的现代光束线必须满足这些要求，同时考虑到独特的光束线特定的因素，如上游光学元件和物理约束(包括仓内的物理空间和几何限制)。现代光束线还详细阐述了这些一般要求与额外的聚焦光学，探测器的专门电子设备，改善光束和/或样品位置稳定性的容器，以及许多其他组件，这是典型的独特的从光束线到光束线。

X射线的吸收发生在原子水平上，因此，一种元素不可能在光谱上保持沉默，或者在样品中被隔离，从而可以用这种技术逃避检测。在单色激发能下，发出的X射线荧光光谱仪不能提供元素的化学信息。以something3313eV为中心的发射峰的检测可能来自K-Kα荧光，但是由于缺乏化学信息，从技术上讲，元素图并不是K+的图谱ーー尽管在像K和Cl这样的元素的情况下，例如电离形式K+和Clーー是可能的形式，因为离子具有非常有利的水合自由能

术语“成像”和“映射”在某种程度上可以互换使用，比如X射线荧光光谱仪成像(XFI)和X射线荧光光谱仪成像(“XFM”，不要与X射线荧光光谱仪显微镜混淆)，尽管在某些领域，比如医学，术语之间有更大的区别。

通常，映射是用单个探测器元件(或一个探测器加起来的多个探测器元件)来产生一个信号在一个单色X射线束照射的样品上的一个点。通过光栅扫描样品通过光束是可能的地图元素的分布像素一个像素。

另一方面，成像技术可以在一次拍摄中捕捉到样本的一个区域，就像用传统的X射线摄影技术拍摄照片或拍摄胸部X射线一样。尽管与传输相比，成像方法在X射线荧光光谱仪中并不常见，但是这种成像技术可以应用到比相机视场大的样品上，通过光束对样品进行光栅扫描，类似于制图方法，并从多幅平铺图像中获得更大的视野。撇开方法学考虑不谈，制图或成像原则上可以提供相同的元素分布图。

显微学广泛地涵盖了研究人类肉眼无法看到的微观细节的研究领域。因此，我们将采取一个不可知论的立场，关于这里的术语成像和映射，并使用XFM的意思是X射线荧光光谱仪显微镜，而不是一个特定的方法来获取数据。然而，在技术上，本文描述的方法主要基于映射方法。

除了XFM，还有一系列可用于元素制图的分析技术，例如激光烧蚀感应耦合电浆质谱分析仪(LA-ICP-MS)、飞行时间和纳米二次离子质谱法(分别为ToF-SIMS和nano-SIMS，以及相关方法)、电子能量损失谱和能量过滤透射电子显微镜、X射线光电子能谱、能量色散X射线光谱仪和质子诱导X射线发射能谱(PIXE)。

对这些方法的进一步描述超出了本文的范围;然而，感兴趣的读者会发现大量关于这些技术及其在生物组织元素定位中的应用的优秀评论。虽然前面提到的所有技术都提供了元素定位能力，但是XFM在生物样品分析方面提供了几个明显的优势。

首先，XFM本身并不需要在真空条件下进行分析(正常情况下使用离子束或电子束的技术所需要的)。此外，用离子或电子束分析(或检测离子和电子)本质上是表面敏感的。尽管这可能是有利的，特别是在材料科学中，与X射线(以及粒子诱导的X射线发射，PIXE)相关的更大的穿透和信号检测深度通常提供更具代表性的细胞和组织中的二维元素分布的图像。

与台式仪器相比，同步加速器x射线源提供了更高数量级的光子通量，这使得它们特别适合于微量元素常见的生物应用。根据通量和样品特征，在样品上的每个位置(停留时间)获得荧光光谱的时间可以<1ms，并且可以检测元素的亚微摩尔浓度，尽管单位通常是面积浓度。

该技术的另一个优点是，该技术同时具有多种元素，而传统的技术，如基于质谱检测的技术，仍然是连续的。生物标本在元素浓度上表现出较大的动态范围，这使得可视化具有挑战性。一个例子是同时比较骨中P的可视化与相邻组织中该元素的变化(例如图1)。

图1 在C57BL/6小鼠中的元素映射示例，沿着矢状面切片，离开中线。将整个身体在2.5%甲基纤维素块内冷冻，冷冻切片至100μm厚度，收集到粘合剂Kapton膜上，并在解冻前在-20°C风干48小时。在SSRLBL7-2获取的数据。

XFM实验在表征生物标本时也需要一种灵活的方法，而且光束线必须能够(i)以足够的空间分辨率适应大量标本类型的映射以解析所需的生物细节，(ii)具有足够的通量以允许检测痕量元素，以及(iii)具有解析具有足够的信噪比(SNR)和峰值清晰度以区分元素的离散x射线的能力。显示和分析结果还要求以传达信息的空间分布以及基础数据中浓度的动态范围的方式提供数据。

XFM的光束线可以针对特定的能量范围和光束大小进行优化(因此可以针对特定类型的样品或分析进行优化)，或者可以是万能型的，提供广泛的能力并适应不同的样品类型和尺寸。基于同步加速器的XFM的另一个好处是，角色塑造可以与其他同步加速器技术相结合，例如断层扫描、共聚焦成像、μXAS或CSI。

1.M Jake Pushie, Nicole J Sylvain, Huishu Hou, Mark J Hackett, Michael E Kelly, Samuel M Webb, X-ray fluorescence microscopy methods for biological tissues, Metallomics, Volume 14, Issue 6, June 2022, mfac032, https://doi.org/10.1093/mtomcs/mfac032.

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