【摘要】 本文详解抗体亲和冷冻电镜网格技术原理，涵盖标准化操作流程、电场辅助富集方案及在病毒学、蛋白质动力学研究中的创新应用，助力低浓度样本的高效结构解析。

在生物大分子结构解析领域，基于抗体的亲和冷冻电镜网格技术正成为突破性解决方案。该技术通过靶向富集低浓度样本，成功克服了传统冷冻电镜对高浓度样品的依赖，为病毒学、蛋白质动力学研究开辟新路径。

 

一、技术原理与核心优势

A传统制样流程样本易流失，B亲和网格实现靶标富集

图1 在冷冻前在规则和亲和TEM网格上进行样品印迹。（A）常规TEM网格上的高体积浓度样品。（B）低浓度样品集中在亲和TEM网格表面。

传统冷冻电镜技术需1mg/ml以上样本浓度（如病毒悬液），而抗体亲和网格技术通过以下创新实现突破：

1.靶向捕获：碳膜表面修饰蛋白A/G，定向固定抗体形成"分子陷阱"

2.浓度放大：样本缓冲液中靶标颗粒被特异性捕获，浓度提升10-100倍

3.流程整合：同步完成样本纯化与制样，减少降解风险（Yu et al., 2016）

 

二、标准化操作流程

2.1 网格预处理

（1）抗体固定：50μl/ml蛋白A溶液室温孵育10分钟（IgG类抗体建议改用蛋白G）

（2）抗体负载：移取3-5μl抗血清/纯化抗体，湿度控制下反应15分钟

（3）缓冲清洗：PBS冲洗10-30秒去除未结合抗体

2.2 样本富集优化
  • 被动扩散法：适用于≥10^8颗粒/ml样本，孵育30-60分钟
  • ​电场辅助法​（创新点）：
    • 介质电泳：中性分子通过极化迁移加速富集
    • 电泳富集：负电性生物大分子向阳极定向移动（pH7.0缓冲体系）

 

三、技术突破与应用场景

从抗体修饰到样本加载全流程示意图

图2 SPIEM辅助低温电镜样品制备原理图。

1.低丰度样本：成功解析10^7颗粒/ml的病毒衣壳中间体

2.动态过程捕获：蛋白质折叠中间态捕获效率提升80%

3.临床诊断应用：血液样本直接上样，省去超速离心步骤

 

四、技术发展前瞻

通过整合微流控芯片与自动移液系统，该技术正在向高通量冷冻电镜平台演进。最新研究显示（Nature Methods, 2023），结合AI算法的亲和层设计可将靶标捕获特异性提升至99.2%。

 

参考文献：1.Yu, G.;  Li, K.; Jiang, W., Antibody-based affinity cryo-EM grid. Methods 2016, 100, 16-24.

 

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