X射线衍射Rietveld全谱拟合法

前言

药物的晶型决定了其稳定度、溶解度、生物利用度等理化性质，是直接影响药物临床疗效、安全性的重要因素。药物在生产、储存过程中若条件控制不当，容易出现转晶、降解产物，因此原料药、制剂的多晶型定量分析就显得至关重要。另外，在知识产权部分，目前对化合物专利的申请已经拓展到其所有形态，作为支撑专利保护的多晶型分析及定量方法也日益受到关注。

目前成熟的药物晶型定量方法主要有光谱法（红外、拉曼光谱等）、热分析法、衍射法等方法，定量的主要原理都是根据不同晶型独特的热力学、物理学和化学特性来区分并定量，其中X射线粉末衍射法（PXRD）是最经典、非破坏性、较准确的晶型定量方法，且现已广泛应用于晶型的定量分析和结晶度的测定，接下来本文将着重介绍X射线粉末衍射法。

X射线粉末衍射法

X射线粉末衍射可用于定量混合物中结晶相的强大技术，其可以提供每个物相0.1 - 1wt.%的检出限，广泛应用于制药工业、冶金工业、高分子工业、环境学研究、材料学研究等工业、学术应用的定量分析。《中华人民共和国药典》2015年版四部通则“药品晶型研究及晶型质量控制指导原则”中纳入PXRD定量分析法；国际晶体学会也在其出版的国际晶体学表中专文介绍了PXRD在药物领域里，从晶型筛选、晶型定量、生产质量控制、产品随时间（保质期）的稳定性等评估环节中起到至关重要的作用¹。

晶体是由分子按照固定周期堆叠起来的固体，具有固定的结构类型、晶胞大小、原子位置以及原子数目，因此可以衍射X射线产生特定的衍射花样，其衍射点的距离反应了晶胞大小；衍射点强度反应了原子种类及位置。如图一所示，PXRD实际上就是无数个小单晶衍射叠加的结果，几百万个小晶体随机取向，在单晶X射线衍射中的独立衍射点叠加成了衍射环，每个衍射环的大小(2θ衍射角)通过d值计算。通过扫描2θ，三维空间的倒易点阵被投影在了一维空间，因此d值相等或相近的衍射峰就会发生重叠。因此在混合物粉末中，其衍射相当于每一种物相小单晶衍射的混合叠加。而PXRD法定量的理论基础就是应用此原理，混合物中各物相参与衍射的重量与其产生的衍射强度成正比，因此可以通过衍射峰强度的大小求出参与衍射的重量比例。

图一、单晶X射线与粉末X射线衍射的差异²

^单峰法

^{传统的定量X射线粉末衍射方法更多地依赖于用内标建立的校准曲线，实际上就是基于内标来进行定量。单峰法本质上是建立晶型含量比例于衍射峰强度比例之间的线性关系。该法用于定量的方程为:}

其中K为常数，、、分别为组分i的衍射强度，质量分数及密度，为不同晶型的质量吸收系数。一般而言，同一药物分子不同晶型的差异较小，在定量分析中可近似为相同的常数。衍射强度可以基于峰值强度（高度）、相对峰值强度比或积分峰面积，其与某一晶型的质量分数呈正比。如图二所示的例子，可通过制备一系列不同浓度的标准品，将特征峰衍射强度对质量分数回归得到标准曲线，从而根据此标准曲线来对未知样品定量。单峰法对样品的信息要求小,方法简单、灵敏度高,尤其适于长期晶型定量分析。但是,该定量方法严重依赖标样的纯度、粒度、制样方法，样品择优取向效应会严重影响单峰法的应用。

图二、地氯雷他定晶型I、II混合样品的粉末衍射图谱³

^{Rietveld全谱拟合法}

Rietveld拟合法的原理是使用整个衍射图谱数据进行分析，通过使用峰型参数、晶体结构参数（晶胞参数、原子位置、物相比例等）可以计算出每个2θ位置下对应的模拟、实验强度、，再使用最小二乘法与实测图谱进行比较，经过不断调整精修各种参数最小化模拟-实验差值，使得模拟数据逼近实测图谱。如果晶体的结构已知，积分强度计算公式为：

其中为衍射峰强度，S为标度因子，为多重度因子，洛伦兹因子，为结构振幅。而衍射峰强度正比于标度因子。

物相定量分析计算公式为：

其中为质量分数，为标度因子，为单胞质量，为单胞体积。由以上两个公式可知道标度因子与质量分数为正比关系。

晶体学上使用残差因子（ResidualFactor, R-factor）评估模拟图谱与真实图谱的差异。对于可信的拟合数据而言，其权重残差因子应小于10%。

Rietveld全谱拟合法相对于传统X射线定量方法的优势在与在于不需要标准品、不需要预先研制标准曲线，仅需要混合物中每个相的结构模型（晶格参数、空间群对称性、原子位置、位置占有率）来模拟粉末衍射图谱，即可进行定量分析。更重要的是，全谱拟合法有能力通过数学模型修正择优取向、仪器构造等因素造成的系统误差、重叠峰分峰处理上更为理想，使强度值提取更为准确。

Rietveld全谱拟合法案例一

图三、经过热处理后，卡马西平I型会部分转晶为III型。上图黑线为I型在全谱中的贡献；下图为全谱拟合结果；圆球则是实验数据。2

由图三可以清楚看到Rietveld全谱拟合法在重叠峰严重的体系的优势，卡马西平两种晶型在13度以后高度重叠，只有在10度左右由无重叠的峰。15-17度的小图也展示了全谱拟合法分离重叠峰的能力，通过Rietveld全谱拟合法可以独立地计算每个晶型对衍射的贡献，从而获得更精准的拟合及定量结果。

Rietveld全谱拟合法案例二

背景：水合碳酸镧用于治疗终末期肾病患者的高磷酸盐血症。在制造过程中或储存过程中可能产生脱羧基的碱式碳酸镧杂质。杂质含量往往很低，如果用XRPD单峰法来分析，不能满足检测限的要求。采用Rietveld全谱拟合法则完全能满足检出限能要求。图四是利用Rietveld全谱拟合法对水合碳酸镧进行了定量分析，结果显示无需标准品及预制标准曲线即可能快速，准确分析出碱式碳酸镧杂质的含量。

图四、左图箭头所指为脱羧基的碱式碳酸镧杂质在全谱中的贡献；右图为15度-27度的XRPD之间的Rieveld全谱拟合结果。

结论

PXRD是多晶型定量的主要⼿段，但单峰法受到样品制备过程、晶体粒度、晶习所造成的择优取向会严重影响定量分析的准确度。Rietveld全谱拟合法虽然需要预先知道晶体结构，但起能够引入数学校正择优取向等误差来源，使其定量准确度、可靠性远超过传统的单峰法。

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