高分辨质谱在毒物筛选分析中的应用

在法医毒物分析工作中，分析目标物的不定性以及毒物种类的广泛性导致了法医毒物鉴定的复杂性。因此，对于未知物的筛选和确证已受到法医毒物分析工作者越来越多的关注。随着科技发展和仪器进步，出现了多种毒物筛选的方法，主要包括形态学法、微生物法、免疫法、光化学法、电化学法、生物芯片、分子印记、色谱法以及质谱法等。

各种检测方法的弊端

形态学法可以进行初步的筛选与鉴别，为检验提供线索；

动物试验法作为预试手段，可以为毒物检测提供一些参考和依据，但不能作为判别毒物类别的依据；

微生物法主要用于检测动物性食品中抗菌药物残留，它特异性低，有效期短，结果存在一定比例的假阴性和假阳性的；

免疫法可以快速定性检测血清或尿液中的吗啡，海洛因等毒品，但是这种分析方法灵敏度相对较低，且存在生化试剂不能在常温贮藏下长期保持生物活性问题，难以作为最后确认的依据；

分子印记技术虽然具有高度专一性、预识别性，且具有较强的分离与富集能力，仍存在模板泄露、柱效差、制备分子印迹聚合物单体种类少、在水溶液和极性溶剂中不易制备等局限性，难以进行质量控制；

气相色谱或液相色谱法虽然能够通过对照保留时间进行筛选，相比上述检测方法在特异性，灵敏度上都有很大的提高，但对于保留时间相近的化合物无法分离检测。

质谱定性是目前世界上最通用的定性方法之一，色谱作为目前最好的分离工具，与质谱联用可谓是珠联璧合。质谱技术包括低分辨与高分辨，与色谱联用的低分辨质谱包括气相色谱-质谱（GC-MS）及液相色谱质谱(LC-MS)。GC-MS用于筛选分析无需使用标准品，通过库检索就能对物质进行定性，但对于热不稳定，极性大的化合物则需要衍生化，过程繁琐费时，也不适用于难挥发的化合物。以及在毒物分析领域都有着极其广泛的应用。液相色谱质谱(LC-MS)用于筛选分析主要有三种类型，离子阱质谱、三重四级杆质谱以及三重四级杆-离子阱质谱（Q-trap））。

LC-MS能够检测分子量大的化合物、高极性化合物、热不稳定化合物等，相比于气质在检测范围及灵敏度都有了很大的提高。但是三重四级杆质谱通常采用的多反应监测模式需要标准品来优化仪器参数，对未知相对分子质量和断裂途径的药物往往无法检测。而离子阱质谱，Q-trap虽然能够做全扫描分析，但其灵敏度受检测化合物数量限制， 当筛选的化合物越多时，对灵敏度的影响也越大。高分辨质谱凭借其超高的分辨率和精确质量数功能解决了上述液质方法的不足，特别是在多组分筛选方面。基于精确分子量的数据库能够包含非常多的化合物，可以进行快速筛选，在毒物分析领域得到越来越多的应用。本文综述了高分辨质谱在法医毒物筛选中的应用，并对其在法医毒物分析领域的应用进行了展望。

高分辨质谱简介

高分辨质谱仪具有在超高分辨率下测定化合物精确分子量的功能，并能借助同位素离子的丰度比来推断化合物的元素组成（分子式），通过一级、二级谱库的匹配也能够对复杂基质中的痕量组分进行确证和筛选 。因为分子式一定的化合物其精确分子量是唯一的，借助超高的分辨率，高分辨质谱可以区分复杂背景中的杂质及共流出物，进行痕量分析，降低了对样品前处理的要求，适用于色谱条件优化困难的情况。
除此之外，超高的分辨率保证了复杂样品分析所需的高质量精确度，即使检测无数个化合物也不会损失灵敏度，并且不需要对照品来优化仪器参数。
理论上，高分辨质谱分析的化合物在数量及分子量上都没有限制，并且拥有很高的的灵敏度。高分辨质谱能够进行全扫描分析，其生成的数据文件具有可回顾性，可对历史数据进行重新分析。除了上述相比于低分辨质谱的优势，高分辨质谱还能够根据精确质量数来推测未知化合物的元素组成，为筛选提供线索。现在用于筛选的高分辨质谱仪主要以傅立叶变换静电场轨道阱质谱Orbitrap以及四级杆-飞行时间质谱Q-TOF（包括TripleTOF）为主。

毒物分析中的应用

1、滥用药物及临床药物
全扫描质谱的高灵敏度以及高分辨质谱的高分辨率、精确质量数功能，使得Orbitrap和Q-TOF都非常适合用于多组分的筛选。他们在定性方面也有其独特的优势。通过精确质量数以及窄质量窗能够从全扫描质谱信息中得到选择性很高的提取离子流图，减少同质异素化合物产生的干扰。利用同位素分布（如碳、氯、溴、硫等元素），能为从精确质量数推断分子组成提高准确度。所以它不需要预先设定待测物。而是在检测结束后，对获得的质谱信息进行分析。这种方法，不但能一次分析大量的目标化合物，还能检测出非目标化合物，因此无需使用相关标准品再进行实验。
利用液相色谱串联高分辨质谱建立了环境样品中76种滥用药物如苯丙胺类、阿片类生物碱、吗啡类、致幻剂、大麻、苯二氮卓类及临床药物如解热镇痛药及其代谢物的筛选和确证分析方法。

作为第一个把高分辨质谱应用于毒物分析领域的团队，Ojanpera等人首次建立了毒物相关化合物及其代谢物的数据库。该数据库基于精确质量数，不需要标准品，只需知道新化合物的分子式就能添加入数据库。随后用该数据库搜索由TOF分析得到的全扫描质谱数据。实验及经验表明，仅仅用精确质量数和同位素分布比对，还不足以满足检测的要求，可以用由CID裂解产生的碎片离子来提供额外的结构信息。而对于很多无法获得标准品的新型滥用药物，可以采用一种新方法，即In silico 方法。In silico指通过软件预测化合物可能的代谢物，并把其精确质量数添加到数据库中。除此之外，软件还能预测化合物的碎裂方式，这在同分异构体分析中特别有帮助。实验表明，软件预测的代谢物只有部分能在真实样品中找到，而不是全部。这种基于软件预测及精确质量数的方法能为定性分析提供许多有用的数据，但是仍然需要更多的数据来表明此方式是否最终足够可靠，适用于缺少标准品的化合物定性。
Donata Favretto 等人使用LTQ-Orbitrap对2名双胞新生儿的胎发（2.5mg）进行全扫描筛选分析（质量精度在0.9-4.9ppm）。除了检测出万拉法星原体，还得到其四种代谢物，即O-去甲基万拉法星、N-去甲基万拉法星、N,N-二去甲基万拉法星、N,O-二去甲基万拉法星。万拉法星的含量分别为10ng/mg和12ng/mg 。
John C. L. Erve等人使用C18 ZipTip柱对大鼠的脑微渗析液去盐后, 使用配有Triversa NanoMate的LTQ-Orbitrap，采用维拉帕米作为实时监控的内标，经过全扫描分析和质量亏损筛选，检测出4种中枢神经药物，即丙咪嗪、瑞波西汀、西肽普兰、曲唑酮及其代谢物。除上述化合物外，还发现羟基丙咪嗪葡萄糖酸苷、去乙基瑞波西汀及其葡萄糖醛苷等6种未曾报道的脑内代谢物。实验证明，ZIPTIP柱不但可以去掉盐分，并且保持了高回收率。在监测含量极低的代谢物时，使用100,000分辨率， 质量精度仍然能到达到<1ppm。 

2、农药高分辨质谱应用于农药筛选分析得报道较多，如利用LC-Q-TOF或Orbitrap在谷物、蔬果饮料筛选上百种的杀虫剂。有文献报道使用二维气相色谱飞行时间质谱筛选及定量动物饲料中杀虫剂。还有文章中提到建立专门的杀虫剂数据库用于筛选分析。

3、兴奋剂反兴奋剂实验室一直致力于建立已知违禁药物以及有潜在被滥用可能药物的分析方法。在反兴奋剂检测中得到越来越多应用。E.D.Virus和他的团队建立了29种兴奋剂的Orbitrap检测方法，包括抗雌激素作用物质、β2激动剂、代谢类固醇以及其他类固醇物质。他们使用APCI作为离子源，因为APCI能够更好的从基质中分离低浓度的类固醇。质量精度为0.3-1.6ppm，方法灵敏度优于2ppm，检出限均小于100pg/ml。皮质类固醇和利尿剂对检测没有影响，表明方法特异性良好。他们检测了一份兴奋剂阳性样品，结果显示epimetendiol成阳性。
F. Badoud使用UPLC-Q-TOF 筛选尿液中103种物质，包括刺激剂、 利尿剂、麻醉剂、抗雌激素剂等。他们使用C18色谱柱，分析时间9分钟 （3分钟平衡） 正离子、负离子两种全扫描模式进行分析， 从精确质量数和保留时间进行自动筛选 质量精度在±0.05da。
另外，对经过结构修饰化合物的分析，高分辨质谱具有独特的优越性。比如结构修饰的合成类固醇是对现有类固醇产品在结构上做轻微改动,从而逃避已有的检测方法。高分辨质谱根据精确质量数来推测未知化合物的元素组成，为筛选提供线索。

展望

具有在超高分辨率下测定化合物精确分子量功能的高分辨质谱与具有强大分离功能的色谱技术完美结合，利用测得的精确质量数、同位素离子的丰度比、及一级、二级或多极谱库的匹配对对非目标化合物、未知化合物定性分析，将会成为化学筛选分析的一种趋势。