负染色技术-研究亚细胞成分的宝贵技术

负染色是用于制备颗粒样本的最常用的程序，细胞器、大分子和病毒，用于电子显微镜。其主要优点是快速，只需几分钟的准备时间。另一个是它避免了一些刺激性化学物质，例如，有机溶剂，用于薄切片。此外，它不需要高级技术技能。它被广泛用于病毒学，无论是在病毒的分类以及病毒性疾病的诊断。尽管需要相当高的颗粒计数，但通过阴性染色进行病毒鉴定是有利的，因为不需要特异性试剂，如抗体、核酸探针或蛋白质标准品，这些试剂需要潜在病原体的先验知识来选择适当的试剂。此外，它不需要活的病毒体，如在组织培养中生长。另一个使用负对比的程序是超薄冷冻切片。

1954年，Farrant首先发表了负染色材料铁蛋白颗粒^[1]。Hall和Huxley后来用磷钨酸（PTA）染色病毒^[2,3]，Brenner和Horne在1959年创造了负染色一词。Horne和Wildy出版了负染色的历史^[4]， Hayat和Miller出版了配方、方法、支持膜和病毒学用途的详细纲要^[5]。

该方法利用重金属盐包围颗粒，在干燥时支撑它们，并使颗粒中的支撑膜和裂缝变暗。醋酸铀酰和PTA是最常用的染色剂。PTA的优点是不具有放射性;然而，它不起固定剂的作用，并且在某些情况下可以主动降解病毒。虽然使用PTA可以立即检查病毒，但如果未首先在戊二醛中固定，则在网格储存后一些病毒会降解。这需要在负染色之前用水洗去缓冲液。乙酸铀酰颗粒更细，不易过度染色，即使在网格上长期储存也能保留病毒的超微结构。通过在液滴上铺设网格然后用滤纸排水来施加染色剂。

为了使样品和染色剂在膜上良好地铺展，膜应该是亲水性的，这可以通过使用新的碳涂层膜，通过在真空蒸发器中辉光放电旧膜，或通过使用铺展溶液（如聚-L-赖氨酸或阿尔新蓝）来实现。不可能对膜的寿命施加时间限制，但一个指导是尝试它们，如果样品铺展不好或染色剂出现玻璃状，而不是颗粒状，则可能是时候辉光放电了。具有高浓度盐污染物的样品（例如，粪便）可以比更纯的样品（例如，脑脊液或来自分离梯度的条带）。将颗粒样品施加到网格上的最简单和最常用的技术是将网格以膜侧朝下的方式放置在一滴样品上。另一种技术是将样品喷雾到网格上，有时在甘油（高达30%）中。这个过程对小蛋白质有好处，有助于它们扩散，而不是聚集在自己身上，但它永远不应该用于潜在的致病物质。这两个程序适用于定性工作，但对于颗粒计数，必须进行离心到网格上（或用于薄切片的过滤器）。

• L. Farrant, Biochim. Biophys. Acta 13(1954)569.
• E. Hall, /. Biophys. Biochem. Cytol. 1(1955)1.
• E. Huxley, Proc. Stockholm Conf. Electron Microsc. (1957)260.
• Brenner and R.W. Home, Biochim. Biophys. Acta 34(1959)103.
• W. Home and P. Wildy, /. Microsc. 117(1979)103.

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