【摘要】 上海交通大学叶坚教授课题组发明了数字胶体增强拉曼光谱（dCERS），利用胶体纳米颗粒，可以实现较高效率的单分子检测。

数字胶体拉曼光谱助力分子定量检测

 

拉曼光谱，发现于1928年，是基于激光和分子非弹性散射的技术，通过光激发分子振动而产生的散射光子能量变化，为分子提供了独特的“指纹”，能够区分不同类型的分子。并获得了1930年颁发的诺贝尔物理学奖。但拉曼光谱的信号弱，限制了它的应用。1974年，发现当分子吸附在粗糙的银电极上时，拉曼散射信号显著增强，开启了表面增强拉曼（SERS）技术的发展。SERS的关键挑战是信号的空间和时间变异性，这与溶解分子需要吸附在金属（如金或银）表面的特定“热点”上，并且在那里停留足够长时间以增强信号有关。由于分子运动和吸附的随机性，开发一致可靠的SERS方法难度大。后续，通过金属表面的精确设计和热点规范化，以及数字SERS技术的引入，改进了SERS的可重复性和定量性，数字SERS计算空间离散拉曼信号的数量，提高了检测限。这些进展虽对许多应用有价值，但并非适用于所有情况，如生物细胞中的应用。

 

在此，上海交通大学叶坚教授课题组发明了数字胶体增强拉曼光谱（dCERS），利用胶体纳米颗粒，可以实现较高效率的单分子检测。由于能够增强这些振动特征的金属纳米胶体粒子（包括羟胺还原银胶体）可以在常规条件下大规模制造，作者预计数字（纳米）胶体增强拉曼光谱将成为可靠、超灵敏地检测各种分析物（包括对人类健康非常重要的分析物）的首选技术。相关成果以“Digital colloid-enhanced Raman spectroscopy by single-molecule counting”为题发表在《Nature》上，第一作者为毕心缘。

 

 

在此系统中，作者使用含有 10 μl 金属胶体悬浮液的石英毛细管（内径 1 毫米）来生成目标分子的增强拉曼光谱（图 1a）。使用扫描探针系统以点扫描模式获取每个样品的拉曼光谱。与固体基底不同，单分散银胶体在整个悬浮液中呈现均匀分布，确保了整个数据采集室中胶体与目标相互作用的概率几乎一致。为了满足连续采集测量的独立性标准，采集时相邻体素的间距要足够大（此处为 10 μm），以尽量减少重复采样的可能性。数字化时，如果特定振动特征的信号高于预设阈值，则将每个体素定为正值（"1"），否则定为负值（"0"）。

 

为了展示 dCERS 的概念，作者按照上述程序研究了不同浓度下的几种代表性目标分子。图 1b以水晶紫为例，其中的特征峰从 780 cm-1 到 820 cm-1（平面外 C-H 弯曲），在这一范围内出现了独特的峰值。为了给每个象素分配 "1 "或 "0"，将 Is 与预设阈值进行比较。根据经典的吉布斯热力学，低浓度分析物吸附事件的 RPV 与浓度的关系可以用一条 R2 = 0.99 的直线很好地描述（图 1c）。作者注意到这种关系并非水晶紫所独有，从相对简单的葡萄糖到多核酸和蛋白质，在对数-对数图上都表现出相同的线性关系（图 1d-h）。在实际应用中，只要对每种分析物和/或每批制造的胶体进行预校准，分析物浓度与单分子事件之间的这些单调对应关系的高度可重复性应足以将测得的 RPV 转换为实际浓度。

 

图1：dCERS的概念

 

作者评估了测量准确性，认为基于单分子的测量应遵循泊松分布，测量误差即单分子事件总数的平方根。通过多次测量不同浓度，使用水晶紫和Hya-Ag胶体作为例子，计算了各浓度的平均误差。结果显示，测量的相对标准偏差（RSD）与泊松分布一致，表明测量准确性随正向体素数增加而提高。例如，水晶紫在特定浓度下，正向体素增加时，RSD显著减少，符合平方根法则。这表明，基于单分子事件的测量准确性受累积正向事件影响，与测量时间和背景假阳性数量有关，与分析物浓度或检测效率无关。从预校准曲线中可恢复实际分析物浓度及准确性。

 

图 2：dCERS 的再现性

 

为验证dCERS有效性，作者对混合的水晶紫和尼罗蓝在不同浓度下进行定量，利用尼罗蓝的特征峰区间信号进行数字化处理，与结晶紫的特征峰不重叠。实验结果显示，即使在极低浓度下，也能准确测定两种分析物的浓度，且测量结果与单分子事件的预期一致，遵循泊松统计。这证明了dCERS能够基于特征SERS信号，在广泛浓度范围内同时定量多个目标分析物，条件是分析物浓度足够低。

 

作者通过检测溶液中的百草枯（一种可能引发帕金森病的高毒性除草剂，已在32个国家禁用）来测试dCERS的检测能力。使用Hya-Ag胶体，在10-8 M至10-10 M浓度范围内对对草快进行校准，获得的RSD为11%，这一浓度远低于欧盟规定的最大残留水平。此方法能检测到远低于传统UV分光光度法的百草枯浓度。此外，作者还在湖水样本中成功检测百草枯，即使在复杂背景下，通过稀释也能准确测定浓度。同时，作者将dCERS用于检测噻脒（一种被欧盟分类为2类致癌物的高毒性杀菌剂）。在纯水中建立噻脒的校准曲线后，作者在豆芽提取物中测定了其残留量。尽管原始浓度下测量值较低，但通过进一步稀释，恢复了与校准相同的线性关系，显示出在极低浓度下的稳定可靠性，远低于液相色谱-质谱联用技术的检测限。

 

图3：dCERS定量检测痕量化学物质

 

小结：dCERS是一种基于目标分子内在振动特征的有效、高效技术，适用于极低浓度下的分子定量。通过对有毒化合物（如对草快和噻脒）的检测，dCERS展示了其在环境保护、食品安全等领域的应用潜力，特别是在追踪对人类健康潜在威胁的化学物质微量存在时。