生物扫描电子显微镜在表面结构测定中的应用

多年来，扫描电子显微镜（SEM）一直被用于提供生物样本的高分辨率表面图像。它比光学显微镜提高了分辨率，再加上大景深，非常适合观察一系列样本类型，但对生物样本成像的挑战是在不改变其形态的情况下准备样本进行成像。因此，无需处理即可查看水合、不导电的样品使得可变压力SEM成为观察生物样品的一种有吸引力的技术。

探索环境扫描电子显微镜（ESEM）在生物样品高分辨率成像中的应用，并与SEM在该领域的应用进行比较，特别是参考两种成像技术可能产生的伪影和样品损伤源。以哺乳动物细胞为例研究，这对这两种技术都提出了挑战，表现出其表面结构的极其精细的细节和对环境条件的高度敏感性，我们希望确定ESEM在生物样品的高分辨率成像方面的优势，并概述该技术的局限性。为此，我们首先回顾了生物样品的标准SEM制备技术，并简要描述了ESEM仪器的操作。

ESEM是对SEM的改编，它消除了对先前讨论的许多样品制备处理的需要。样品在气体分压下成像，这是通过使用一系列限压孔径和沿柱长度的差分泵来实现的，将电子源保持在超高真空下，并将大部分束路径保持在高真空下。通过使样品靠近最终孔径并连接一个圆锥体，使通过样品室中低真空区域的路径最小化（图1a）。

图1 （a） VPSEM仪器中不同压力区域的示意图；（b） VPSEM中的级联放大

光束在样品室中确实会经历一些散射，并且散射量将根据光束气体路径长度、室压力、加速电压和气体类型而变化。然而，大部分光束保持聚焦，产生与SEM中可用的探针直径相同的探针直径，这意味着基本上不会损失分辨率。然而，散射的电子会影响图像的信噪比，产生分布在样品表面的电子“裙”。除了在高压下，这不会显著损害图像质量，但在EDX的情况下是有问题的，使得任何结果都是纯定性的。Sigee&Gilpin等人^[1]光束边缘意味着X射线的相互作用体积显著加宽，尽管确实存在纠正更改的程序，但其有效性值得怀疑。

Shimizu&Ding等人^[2]研究出束电子进入样品并产生SEM中的二次电子。在离开样品时，二次电子被检测器场加速。由于这些电子的能量比初级电子束低得多，它们与气体原子的相互作用更强，并发生电离碰撞，每一次碰撞都会产生一个额外的电子。然后，这两个电子都被加速，进而发生碰撞，每一步的电子数量都会翻倍。这个过程被称为气体级联放大，允许信号在检测之前被放大（图1b）。

在SEM中，在一定范围的加速电压下进行成像；然而，发现5–10 kV可以提供SE信号的最佳表面定位，从而获得最佳的图像质量。使用0.1–2 nA的束流，并使用FEI XL30 FEG仪器（FEI公司，Hillsboro，Oregan，USA）中的标准Everhardt–Thornley检测器拍摄图像。对于ESEM，通过改变电压和光斑大小来优化成像条件，以找到最大化样品表面特征之间对比度的设置。研究发现，对固定的人类MDM成像的最佳条件约为0.4–1.6 nA，4–7 kV，如图2所示。然而，对图像质量的判断不可避免地是主观的，并且应该注意的是，优化的条件将根据样本类型而变化。

图2 将人MDM固定在4%戊二醛/PIPES中，储存在HEPES中，并在FEI XL30 FEG VPSEM中成像前在去离子水中冲洗；样品电压变化如下：（a）−2 kV、（b）−3 kV、（c）−4 kV、（d）−5 kV、（e）−7 kV、（f）−10 kV、（g）−15 kV、（h）−20 kV。

[1] Sigee, D.C. & Gilpin, C. (1994) X-ray microanalysis with the environmental scanning electron microscope: interpretation of data obtained under different atmospheric conditions. Scanning Microsc Suppl. 8, 219–227.

[2] Shimizu, R. & Ding, Z.J. (1992) Monte-Carlo Modelling of Electron-Solid Interactions. Rep. Prog. Phys. 55, 487–531.

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