【摘要】 通过使用共聚焦激光扫描显微镜检查法(CLSM) ，可以克服上述与微粒的机械切片有关的限制。

微胶囊化是将纯原料药或混合物涂覆或包裹在保护材料或系统内的过程。因此，有用的和其他不寻常的特性可以赋予微胶囊成分，或者无用的特性可以从原始成分中消除。颗粒涂层微胶囊化工艺最终产品的性能基本上取决于质量方面，如微粒涂层的厚度、质量和形态。

 

因此，对微胶囊化过程的更好控制，促进了通过调整涂层厚度来监测涂层过程的测定。而一个太薄的涂层将失败在其所需的性能(保护，控制释放，等) ，太厚的涂层将导致延迟释放，增加涂层过程的时间，因此，增加成本。

 

确定包衣过程终点的一项基本技术，通常应用于片剂，是在包衣过程中取样，称量已知的样品大小，并确定理论上添加的包衣量。首先，这个信息假定在整个片剂表面和不同片剂之间有相同的涂层厚度。其次，对于微粒(100-500μm) ，这种技术显然有实际的局限性。

 

显微技术如扫描电镜和常规荧光显微镜检查法的适用范围仅限于样品表面。因此，为了能够研究片剂或微粒周围的涂层，这些必须被切成两个或更多的部分。因此，这个程序拥有属性了大量可能存在的实际问题和人为因素。通常情况下，颗粒被切成两段，用扫描电镜或荧光显微镜检查法成像。据报道，单调乏味的规程是为了确保颗粒在赤道面中切割。对于较小微粒的机械切片，显然更难控制切片平面。

 

原子力显微镜检查法通过使用尖锐的探针在样品表面进行光栅扫描来研究微粒表面的粗糙度。根据检测到的偏转，生成地表地形图。原子力显微镜的优点是比电子显微镜检查法(EM)提供更好的分辨率(亚微米范围) ，并且能够非破坏性地表征非导体表面。原子力显微镜的主要限制是热起伏和探针尖端的有限尺寸。

 

此外，近红外光谱可以用来预测薄膜涂层厚度发生光谱变化时，涂层厚度变化。然而，用这种方法研究的薄膜厚度范围从25微米到75微米不等。这些数值相当大，是制药业的特点，但大大超过了通过例如流化床涂层技术获得的传统食品配料涂层(5-10μm)的厚度。因此，近红外光谱不能保证所需的空间分辨率。

 

激光诱导击穿光谱(LIBS)是一种元素分析技术，能够以最少的样品制备，快速研究微粒表面和内部成分的分配，但与近红外光谱有同样的缺点，因为取样直径约为500微米，每个激光脉冲的穿透深度为10微米。然而，对于较大的片剂，LIBS 有潜力提供多个样本的快速在线分析和片剂内包衣均质性测定所需的空间分辨率。

 

通过使用共聚焦激光扫描显微镜检查法(CLSM) ，可以克服上述与微粒的机械切片有关的限制。在这种方法中，操作者被允许在任何期望的平面上对微粒进行光学切割。安德森等将其归因于使用荧光显微镜检查法的优势，即基于荧光强度的差异，可以区分核心和涂层。然而，Ruotsalainen 等表明，CLSM 在研究薄膜-芯界面方面甚至更强大。在他们的工作中，只有涂层被荧光标记，因此，可视化的 CLSM。

 

CLSM 作为一种非破坏性和方便的微胶囊研究方法的潜力是非常高的。这是由 CLSM 充分显示海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊的不同组分的能力得出的结论。此外，CLSM 结合计算图像分析可以定量测定复凝聚法制备的微胶囊壁材的厚度和组成。Lamprecht 等的另一项研究表明，使用 CLSM 可以快速确定包裹油相的位置和数量。包裹的油相和微胶囊本身的球形形状促进了 CLSM 图像的定量化。Zimmermann 等使用 CLSM 验证了海藻酸钠微囊的制备技术。结果表明，CLSM 可用于胶囊性能的常规评价。

 

CLSM 图像分析

共焦记录的图像分析使用软件 Image J 1.32 j进行。图1给出了一个原始图像及其后续处理的例子。为了提高图像信息内容的萃取，降低卡尔曼过滤的背景噪声是达到区分荧光涂层和非荧光环境所需的对比度的第一步。为了测量与物体尺寸和形状相关的特征特定参数(在这种情况下是玻璃珠周围涂层的两个边界) ，必须从图像中分割感兴趣的物体。首先，将8位彩色图像转换为8位灰度图像，其中每个像素的灰度值介于0(黑色)和255(白色)之间。利用图像 J 的自动阈值函数对灰度图像进行分割，以区分涂层与环境。所采用的算法类似于 Riddler 和 Calvard最优阈值法。在应用 Image J 自动阈值后，图像只包含两个灰色值: 黑色(灰色值: 0)背景(包含玻璃珠核心和涂层玻璃珠的环境)和白色(灰色值: 255)涂层。在得到的二值图像中，在被涂覆的颗粒周围构造一个椭圆，并且从椭圆形的质心到边缘，确定沿着大半径的像素灰度值之和。由于只有来自涂层像素的贡献是沿每个半径的像素强度之和的一部分，椭圆周围的径向和的分配是涂层厚度变化的直接指示。考虑到白色像素(255)的灰度值以及像素与微米之间的距离转换，得到了单个微粒的镀层厚度分配。对于图1中的涂层玻璃珠，采样半径为120，因此得到了120个涂层厚度值。对于所有的珠子研究的 CLSM 在这项研究中，采取了样品的每一个程度周围的椭圆形，从而产生360个值的微粒涂层厚度。

 

图1 CLSM 图像分割及进一步处理程序

 

共聚焦激光扫描显微镜检查法(CLSM)是一种适用于薄涂层(< 5μm)小(200μm)惰性球形颗粒涂层厚度和涂层质量的无损检测定量化。结合图像分析，开发了一种 CLSM 协议，可以高精度地定量测量微粒涂层的质量。

 

1.Depypere, P. Van Oostveldt, J.G. Pieters, K. Dewettinck, Quantification of microparticle coating quality by confocal laser scanning microscopy (CLSM), European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,Volume 73, Issue 1, 2009, Pages 179-186, ISSN 0939-6411, https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2009.04.007.

 

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