生物荧光显微镜使用短焦距成像透镜

细胞的生物荧光是如此微弱，以至于生物荧光显微镜是使用超弱光成像相机进行的。尽管随着时间的推移，这类相机的图像传感器已经有了很大的改进，但直到现在，这种改进才能在显微镜上商业化。K. OGOH^[1]等人定制了用于生物荧光成像的显微镜的光学系统。

因此，用传统的物镜和彩色成像相机就可以捕捉到细胞的生物荧光图像。由于生物荧光显微镜不需要激发光，它缺乏与荧光成像相关的光毒性，并允许对活细胞进行长期、非致命的观察。因此，生物荧光显微镜将是细胞生物学中的一个强有力的工具，与荧光显微镜相辅相成。

基于萤火虫荧光素-荧光素酶反应的生物荧光分析作为与ATP代谢相关的化学反应的生物荧光报告而在分析和临床化学领域得到了广泛的发展。自从萤火虫荧光素酶基因被克隆以来，荧光素酶已被用作报告酶来分析特定基因启动子的活性，因为与氯霉素乙酰转移酶或β-半乳糖苷酶分析相比，它具有更高的灵敏度和操作简单；此外，荧光素酶系统不需要使用放射性同位素。

在荧光素酶测定中，细胞或细胞裂解物发出的光的强度是用荧光计测量的。因此，用这种荧光计方法不可能同时监测启动子活性和细胞特性。单个活细胞中启动子活性(基因表达)和细胞特性的时间推移图像分析对于研究细胞的增殖和分化，特别是形态发生的微观研究是必不可少的。对于这种活细胞成像研究，需要对健康细胞和组织进行长期观察。

此外，荧光分析中的光激发和相关的光毒性不是生物荧光反应的一个因素，从而排除了本底自发荧光和毒性。因此，生物荧光成像是对单个活细胞进行长期观察的理想方法。

在单细胞水平上对启动子活性的生物荧光图像进行了分析，使用配备了超低光成像相机的显微镜，如液氮冷却电荷耦合器件(CCD)相机、光子计数CCD相机和图像增强CCD相机。然而，与传统的CCD相机相比，图像采集时间太长，无法观察细胞生物事件，或者图像分辨率太低，无法检测单个细胞。

因此，在单细胞水平上的生物荧光图像的令人满意的分析尚未获得。最近，电子倍增CCD (EM-CCD)相机，比以前的超低光成像相机产生更高的灵敏度和图像质量，被商业发布并用于生物荧光显微镜。虽然随着时间的推移，超低光成像相机的图像传感器已经有了很大的改进，但直到现在，这种改进还没有用于商业显微镜。

图1. 生物荧光显微镜，LV200。^[1]

生物荧光成像是基于对表达荧光素酶基因或其他发光相关基因的活细胞发出的光的检测。传统的荧光显微镜在将光从样品传输到检测器方面效率低下，需要较长的曝光时间。在这项研究中，他们定制了用于生物荧光显微镜的成像透镜的短焦距，并使用传统的彩色和EM CCD相机对表达甲虫荧光素酶基因的活细胞进行了生物荧光成像。

此外，他们使用深海虾荧光素酶，它比甲虫荧光素酶亮150倍，用于细胞器靶向成像，以显示该系统的空间分辨率。在整个研究过程中，他们面临着生物荧光成像不同于荧光的独特特性。

图2. 四种表达荧光素酶CBG99、CBR、Luc2或NanoLuc的细胞系U2OS细胞生物荧光强度的时间变化。^[1]

他们目前的研究提出了使用短焦距成像透镜的生物荧光显微镜的概念，该系统允许使用荧光素酶捕获细胞和细胞器的生物荧光图像，这与使用荧光蛋白的荧光显微镜相当。

由于生物荧光显微镜不需要激发光，因此它不存在与荧光成像相关的光毒性和背景自身荧光问题，并且允许对活细胞进行长期、非致死观察。因此，生物荧光显微镜是一个强大的工具，在细胞生物学补充荧光显微镜。

[1] OGOH, K., AKIYOSHI, R., MAY-MAW-THET, , SUGIYAMA, T., DOSAKA, S., HATTA-OHASHI, Y. and SUZUKI, H. (2014), Bioluminescence microscopy using a short focal-length imaging lens. Journal of Microscopy, 253: 191-197.

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