【摘要】 生物发光显微镜的例子包括使用生物发光能量共振转移或荧光素酶互补成像来定量的蛋白质-蛋白质相互作用。

生物荧光和放射发光信号都是微弱的现象，需要高灵敏度的显微镜才能在细胞水平上成像。生物发光显微镜是一种具有高灵敏度的研究生物过程的有吸引力的方法。这是可能的，因为生物发光捕获来自细胞的内源性光发射[1]，没有背景信号(例如，自身荧光)和光毒性与外部光源相关。这些特征使得在较长时间内纵向跟踪生物信号成为可能，其时间分辨率从几分之一秒到几十秒不等，空间分辨率在几微米量级。

 

生物发光显微镜的例子包括使用生物发光能量共振转移或荧光素酶互补成像来定量的蛋白质-蛋白质相互作用。钙水平也被纵向测量，使用一种被称为aequorin的荧光素酶变体。最后，荧光素酶已被证明是基因表达的合适报告者，可用于跟踪昼夜节律或其他缓慢的细胞振荡。放射发光显微镜是最近发展起来的一种技术，将放射性核素检测扩展到单细胞水平，从而提供了单细胞放射性标记探针分子运输的定量评估。

 

为了进行放射发光显微镜，在细胞附近放置一个闪烁晶体，每当一个粒子(电子或正电子)从放射标记的细胞中出现时，它就会发出微弱的光学闪光。通过捕捉这种低光现象的图像，我们可以在单个细胞中成像放射性标记探针的分布。要形成图像，可以使用两种方法。最快和最简单的方法是单次长时间曝光(30-300秒)，将许多放射性衰变的光信号综合起来，从而提供放射性核素分布的近似图像。

 

然而，这个图像只是定性的，它遭受了一些扭曲。更定量的图像可以通过捕捉短曝光(通常每次10-100毫秒)的许多相机帧并分别处理每个帧来提取单个放射性衰变事件的位置来获得。然后可以对这些事件进行数字计数，以创建显示其空间分辨率的合成图像。所得到的图像本质上是数字的(因为它对应于检测到的事件的数量)，因此它可以用来获得细胞中放射性核素摄取的定量信息。

图1. 完整组装的LLM[1]

 

LLM背后的原理是通过高数值孔径和低放大倍数允许更多的光汇聚在每个像素上。由式(1a)可知，高NA和低放大倍数(低有效值)的组合将大大增强图像亮度。虽然最理想的解决方案是找到一个显微镜物镜，具有高NA在低放大倍率，这样的物镜不存在。因此，通过使用短焦距(ftube)的定制管透镜(图1)退放大，可以实现低倍率(图1)。将显微镜物镜聚焦在闪烁板的边缘并尽可能靠近细胞来捕获闪烁光(图2)。

 

由于景深有限，显微镜可以有效地看到投影到2D平面上的3D闪烁轨迹的横截面。因此，准确的焦点是至关重要的放射发光显微镜。此外，由于闪烁光起源于离细胞几微米远的地方，因此光场和荧光成像只能用于粗聚焦。此外，电离轨迹可以在闪烁体内部延伸到数百微米;因此，有可能看到尖锐的电离轨迹，但细胞没有聚焦。

图2. 放射发光显微镜原理图[1]

 

[1] Kim, Tae Jin; Türkcan, Silvan; Pratx, Guillem (2017). Modular low-light microscope for imaging cellular bioluminescence and radioluminescence. Nature Protocols, 12(5), 1055–1076.

 

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