激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）-科学指南针

项目简介

一、简介

Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。

二、服务周期

一般为样品接收后的2-3周，具体实验周期及送样时间请与科学指南针工作人员沟通确认，谢谢！

<结果反馈请在测试完成一周内，不建议回收样品，如有需要请提前反馈给指南针工作人员>

结果展示

一、交付内容

1. 选择2D模式拍摄：每个样品交付3-4张图片，其中

（1）若一个样品拍摄1个倍数，拍4个视野；

（2）若一个样品拍摄2个倍数，各拍摄2个视野；

（3）若一个样品拍摄3个倍数，各拍摄1个视野。

<注：除死活染色外，其他项目还会导出明场图片>

2. 选择3D模式拍摄：一个样品拍摄1个倍数，拍1个视野。

二、结果展示

<图一> 颗粒污泥的胞外聚合物EPS的2D和3D图（针对脂质、蛋白和多糖进行染色）

<图二> I:面筋提取物颗粒染色拍照；II：乳胶颗粒染色拍照；III：生物膜细菌的死活分布3D图；IV:细胞死活染色拍照；V：细胞内线粒体定位；VI: 鬼笔环肽细胞骨架染色；VII: 组织免疫荧光（组织内蛋白定位）；VIII:细胞内荧光探针成像；IX：细胞免疫荧光。

<图三> 细胞成像拍摄放大倍数和效果样图

样品要求

一、菌液/污泥/污水类样品

1. 样品量

5000 rpm离心10 min，可得到绿豆大小沉淀，参考图（1.5 mL离心管）大小的菌体沉淀。

2. 寄送要求

（1）若为细菌类需要死活染色/ROS染色的，一般加冰袋泡沫盒4度保存，样品不和冰袋接触。

（2）若为蛋白/多糖类染色，一般加冰袋泡沫盒4度保存或者2.5%的戊二醛固定4度保存，样品不和冰袋接触。

（3）若为污泥类样品可以进行冰切或者刀切，冰切收费50/样。

二、生物膜样品

1. 样品量

金属/瓷砖/岩石等块体类建议长宽高尺寸不超过1 cm，薄膜类直径尺寸不超过2 cm；且均要求样品表面平整，需要标出拍摄面。

2. 寄送要求

（1）一般加冰袋泡沫盒4度保存，样品不和冰袋接触；

（2）若在爬片上培养生物膜，可将爬片粘于培养皿底部，充满培养基，封口膜密封完全，再4度保存。

三、植物类

1. 说明：

（1）植物类样品可进行简单冰切及刀切，软化等特殊类请走病理组织切片测试项目；

（2）一般加冰袋泡沫盒4度保存，样品不和冰袋接触；

（3）平台做过的植物类样品淀粉、胡萝卜，土豆、叶片、根、茎，拟南芥等。

四、需要与细胞共培养的样品

（一）块体类—薄膜、布料、金属块、纸片、凝胶等

1. 送样量

（1）与细胞的作用方式为直接接触的话，至少1个/种细胞/时间点；

（2）样本处理方式为浸提的话，可参考国标ISO 10993-12 2007中的浸提方式浸提，根据浸提方式按量和检测时间点提供；

2. 制样要求

若是需要把细胞接种到材料上的话，金属块、凝胶类样本须制备成统一大小的圆形/方形，建议制备直径为10-15 mm圆形。布料、纸片类样本可代为裁剪，默认制备直径为15 mm。

（二）液体类

送样量：根据测试时样本浓度和检测时间点而定，按照单次检测需要的 3-5倍的量寄送。

a. 若采用稀释后样本测试，则须告知稀释倍数及工作液浓度；

b. 若溶剂为有机溶剂（如DMSO，醇类，酚类等），最高工作液浓度中，溶剂的占比低于0.5%。

（三）粉末类

送样量：根据测试时样本浓度和检测时间点而定，按照单次检测需要的3-5倍的量寄送；

a. 若为可溶性粉末：注明溶剂的种类（如无水乙醇，异丙醇，DMSO，培养基，PBS或者生盐水等），当样品对溶剂有特殊需求时，请在送样时附加所需溶剂；

b. 若为不可溶粉末：注明样本性质，灭菌方式，及分散为均匀悬浮液所需必要步骤。

（五）无需染色直接拍摄类样品

1. 细胞类样品直接拍摄，需要封片后常温避光邮寄。

2. 固体类直接拍摄样品建议长宽不超过20mm，厚度不超过10mm，重量不超过10g，一定标出测试面。

3. 微米材料直接拍摄类建议进行云视频沟通，且微粒尺寸不低于5微米。

其他说明：

1. 激发和发射波长说明：需要提供清楚激发/发射波长，拍摄类型2D/3D，拍摄倍数等要求；

2. 染料说明：需要您标明染料名称和拍摄条件（激发/发射波长）；

（1）指南针常见染色剂及收费见已有染料见激光共聚焦仪器详情常见问题2；

（2）若需要特殊染料，本公司可代购或自行提供（需要附带染色使用说明书）。

常见问题

1. 目前平台共聚焦有哪些激光器配置？

405nm，458nm，488nm，515nm，559nm，635nm，其他激光器需要单独联系。

2. 平台可提供染色剂及收费

染料名称	染色剂使用费	最大激发波长（nm）	激发器波长（nm）	发射波长/范围（nm）	结合物质
Hoechst33342	20	352	350	454	细胞核染料
DAPI	20	359	405	457	可染DNA/RNA
H33342	20	352	405	454	可染DNA、核酸
Hoechst33258	20	352	405	454	细胞核染料
AO染色液	20	490	488	与DNA的结合，其荧光发射峰为530nm;与RNA的结合，其荧光发射峰为640nm	DNA/RNA
CFSE	20	498	488	517	染活细胞
溶酶体绿色荧光探针	150	501	488	509	溶酶体
FITC	20	491	488	516	非特异性蛋白染料可染蛋白/氨基酸/糖类
Nile red (NR)	20	559	559	635	可染脂质
PI	20	537	514（559)	615	可染细胞核
罗丹明B	20	546	561	580	非特异性蛋白染料
耐尔蓝A	20	631	633	660	非特异性蛋白
溶酶体红色荧光探针	150	561	561	592	溶酶体
线粒体绿色荧光探针	150	490	488	512	线粒体
线粒体红色荧光探针	150	578	561	598	线粒体
线粒体深红色荧光探针	150	641	633	662	线粒体
SYBR GreenⅠ	50	498	488	522	核酸
罗丹明123	50	508	488	528	测线粒体膜电位
FITC-鬼笔环肽	100	491	488	516	可染细胞骨架
DCFH-DA	50	504	488	525	可染ROS
Calcein-AM/PI	50	501（537）	488（559）	521（615）	可染活细胞/死细胞
ConA-FITC	50	491	488	516	α多糖
ConA-iFlour 555	50	557	561	570	α多糖
ConA-Alexa Fluor 594	50	590	561	618	α多糖
Calcofluor white	50	350	405	432	可染β-D-吡喃葡萄糖多糖
DiD	50	646	633	663	细胞膜染料
Dil-细胞膜橙红色荧光探针	50	550	561	567	细胞膜染料
DiO-细胞膜绿色荧光探针	50	483	488	501	细胞膜染料
SF633标记鬼笔环肽	100	630	633	650	细胞骨架
罗丹明-鬼笔环肽	100	540	514	565	可染F-肌动蛋白
Syto63	100	657	633	673	可染全部细胞
Syto9	100	485	488	498	可染DNA/RNA
Syto9/PI	100	485（537）	488（559）	521（616）	可染活细菌/死细菌
荧光染料激发/发射波长参考于https://www.aatbio.com/fluorescence-excitation-emission-spectrum-graph-viewer

3. 浸提液常用国标ISO 10993-12 2007介绍

浸提液制备标准-表面积/浸提液体积
厚度（mm）	浸提比例（表面积或体积） ±10%	材料形式举例
＜0.5	6 cm²/ml	薄膜
0.5-1.0	3 cm²/ml	金属薄片、硅片
＞1.0	1.25 cm²/ml	金属块
不规则固体材料	0.2 g/ml	粉末、粒状、泡沫、非吸收剂
不规则多孔材料 (低密度材料)	0.1 g/ml	薄膜、海绵
注意：目前还没有标准的浸提方法来测试吸收剂和吸水溶胀的水溶胶类样本。
注意：目前还没有标准的浸提方法来测试吸收剂和吸水溶胀的水溶胶类样本。