荧光分光光度计的原理及应用

一、荧光分光光度法原理

1. 分子荧光的产生

（1）电子激发态的多重度 单重激发态S：电子自旋方向和处于基态轨道的电子配对。

三重激发态T：电子自旋方向和处于基态轨道的电子平行。

（2）分子能级与跃迁

基态(S0)→激发态(S1、S2激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射。 激发态→基态：多种途径和方式；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；

2. 激发光谱与荧光光谱

（1）荧光的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与激发光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；

（2）荧光光谱

固定激发光波长, 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线(图中曲线II)。问题：荧光(磷光)的激发光波长如何选择？Stokes位移：激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长。

荧光强度和溶液浓度的关系

（1）定量依据

4. 荧光、磷光分析方法的特点

（1）灵敏度高

比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？

分光光度法所检测的是两个较大的信号的微小差别，荧光光度法检测的是很小背景值上的荧光强度。

（2）选择性强

既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；

（3）试样量少

（4）可提供比较多的物理参数

缺点：应用范围小。

二、荧光分光光度计的组成

测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器成直角。基本流程如图： 单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器； 光源：氙灯和高压汞灯，染料激光器 检测器：光电倍增管

三、荧光分析法的应用

1. 无机化合物的分析

与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。

铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；

氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；

铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；

铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；

铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定

2. 生物与有机化合物的分析，见表 ：

本文转自百度文库D粇，链接：https://wenku.baidu.com/view/fc59a757bed5b9f3f90f1c9f.html。