凝胶渗透色谱的测试原理

凝胶渗透色谱的测试原理——————————————————

凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography)，简称GPC，是测试高分子物质分子量以及分子量分布的一种有效手段，那么他是怎么测试出来分子量的呢?lets分析it。

GPC原理：

GPC既然叫凝胶渗透色谱，那么也就属于色谱类的一种，本质上也是对不同物质的分离，他的分析原理是怎么样的呢?

首先，GPC使用的凝胶柱是一种有着密密麻麻多种孔径的凝胶柱子，而高分子物质在溶液中完全溶解之后会根据分子量的大小形成大小不一的一个个分子，当这些分子通过这根凝胶柱的时候，由于分子大小的不用能通过的孔径也不同，因此所经过的路径也不一样，如下面的动图所示，小的分子能经过的孔径数量多，所经历的路径长，反之，大的分子能经过的孔径数量少，所经历的路径就短，在一样流速的情况下，大分子物质先通过所有凝胶柱，而小分子的后面通过所有凝胶柱，从而达到大小分子分离的目的，这个就是GPC分离不同分子量物质的原理。

举个不严谨的比喻，同样需要从广州去到昆明，大分子物质等于是乘飞机，一路直线，而小分子物质等于是乘汽车，一路的蜿蜒盘山公路，必然是汽车所走的路程更长，假设它们速度一致的情况下，也必然是飞机先到达目的地。GPC就是通过这样的方式将分子量大小不一的分子们按照从大到小的顺序排列出来的了，那么我们又是怎么知道这些已经排序完成的分子的分子量各是多少呢?这个就牵扯到GPC检测分子量的多种方式了，并且根据不同的检测方式，也将GPC分成了若干种。

1)传统GPC

传统GPC是直接在凝胶柱后面接折光检测器，当溶解有高分子物质的溶液通过检测器的时候，由于溶液的折射率与纯流动相的折射率不一样，从而判断高分子物质的存在，并且折射率的变化的强度就是溶液中分子的浓度。但是通过这样的检测我们也只是能知道里面有目标分子，并且知道他们的含量和流出时间，怎么又能知道他们的分子量呢?

这个就需要通过建立标准曲线来达到了。通过前面的检测原理我们能得到流出时间，也就是分子走完所有凝胶柱所花费的时间，而根据GPC的分离原理，不同分子量的分子通过柱子的时间是不一样的，因此只要我知道的每种分子量的分子通过凝胶柱的时间就能反过来根据流出时间确定分子量了。我们选择一系列已知分子量的同种高分子，让他们在凝胶柱中跑一趟，测试他们的流出时间，根据流出时间与分子量的对应关系，得出标准曲线，就能通过流出时间确定物质的分子量了。

这个就是传统GPC检测分子量的原理了。它所得到的结果其实是相对于标准物质的分子量，因此测试得到的结果也叫做相对分子量。

但是传统GPC有很多缺点其中受影响最大的一个就是无法得到未知物质的准确分子量。经过实验验证，相同分子量的但是种类不同的分子，在同样的实验条件下的流出时间是不一样的，因此用传统GPC测试分子量的时候我们只能根据不同的待测物选择不同的标品去做标准曲线。

即：我们用聚苯乙烯做的标准曲线只有测试聚苯乙烯的时候是准确的，当测试其他种类的高分子，如聚丙烯酸酯，SBS等其他物质的时候，是会出现偏差的，偏差的大小与样品与标品的相似度有关。

所以当我想知道一个物质的准确分子量的时候，我必须先知道这个物质是什么，然后再采购这个物质的标准品，然后才能测试得到这个物质的准确分子量。当需要测试混合物质或者多组分物质的时候基本就得不到一个准确的结果，因此传统GPC在使用中渐渐被淘汰，取而代之的是改良型的GPC——使用普适校正曲线的GPC

2)普适校正曲线GPC

普适校正曲线的GPC与传统GPC的检测原理基本一直，不同的是在计算标准曲线的时候加入的一个校正因子——特性粘数，高分子的分子量被证明与其溶液的特性粘数有关(这个也就是黏度法测试分子量的原理)。

而特性粘数是一个流体力学的量，因此，通过引入这样一个中间变量就就能对一直物质的标准曲线进行普适校正，使得这个曲线能够适用于所有的高分子物质。

使用普适校正曲线处理数据的时候就会变成以下步骤：

1. 使用单分散性已知种类和分子量的标准品通过GPC测试得出标准曲线。

2. 通过引入这种物质的特性粘数得出普适校正标准曲线。

3. 测试待测物，得到流出时间的结果，带入普适校正曲线得出结果。

4. 通过引入待测物的特性粘数结果进行修正得到准确的分子量结果。

看到这里会有细心的小伙伴发现，这不还是需要知道待测物的特性粘数么?如果我不知道物质种类怎么办?

确实，特性粘数是一个与物质种类有关的物理量，通常已知物质种类的情况下通过查询α与K的值就能得到。但是特性粘数也是可以直接测量的，通过黏度检测器就能直接的得到这个结果。

因此普适校正曲线的GPC也就姑且分为2种，

一种是在传统GPC的基础上通过对数据的处理达到，在已知待测试物种类的情况下，能够做到单一标准曲线测试其他种类样品的准确分子量。

一种是在传统示差折光检测器之后再接入一个黏度检测器，直接测试物质特性粘数，达到通过单一标准曲线测试所有未知物质的准确分子量。

通过普适校正曲线的办法我们就能准确的测试未知物的分子量，因此也可以叫做绝对分子量，这个也是目前市场上使用范围最广泛的一种方法，因为其根本原理还是用过未知物与标准品的分子量对比得到的结果，因此这个绝对分子量通常需要带引号被称为“绝对”分子量。那么有没有真正的绝对分子量呢?有的，这个就是接光散射检测器的GPC。

3)光散射GPC(GPC-malls)

光散射GPC的分离原理其实和之前的GPC也是一致的，不同的只是所接的检测器不一样，之前我们接的是示差折光检测器，通过走标准品之后用流出时间一一对应分子量间接的得到分子量的测试结果，而光散射检测器不一样。

光散射检测器直接能够读出分子的分子量，不需要其他任何的铺垫，它的具体原理类似激光粒度仪测试颗粒大小，高分子在溶液中形成一个个分子的无规线团，就像一个小球，当一束激光照射过去的时候，根据光被散射的情况通过有些公式计算就可以得到样品的微观尺寸，因为高分子在溶液中的形态肯定不会是一个规则的球或者类球，因此单一一束激光是没法确定高分子的分子量的，常见的光散射检测器采用的是十八个角度的光散射检测器，通过十八角度对高分子的照射，收集散射光的信息，最后通过计算机计算直接得出样品的分子量，这个是真正的绝对分子量。

由于光散射检测器只能得出分子量的结果，而没法得到含量的结果，因此我们的示差折光检测器又出山了，一般光散射GPC会使用光散射检测器与示差折光检测器联用，一个测试分子量，一个测试浓度。接光散射检测器的GPC由于没有标准曲线的困扰，对所有物质都可以进行测试，是目前比较先进的GPC测试仪器，但是由于价格比较高，目前还没有被广泛使用。

通过对以上多种GPC的对比我们知道GPC检测技术的更新其实靠着多种检测器的更新联合，因此最新的GPC仪器有采用多种检测器连用的，如接入红外检测器，紫外检测器等等，通过多种检测器的联合数据对未知物进行多种表征。

GPC测试的注意事项：

1. 样品必须能够完全溶解在流动相中，常见的流动相有四氢呋喃(THF)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，氯仿，六氟异丙醇，水，二甲基亚砜(DMSO)，甲苯等。

2. 需要知道大致的分子量预估范围，能让数据更准确，因为不同的柱子与测试条件，标准曲线各自有各自的测试范围，需要根据待测样品的范围进行选择。

PS：举个例子，若所选的柱子不适合，样品分子量太大，没有能过去的孔直接会堵住，样品分子量太小，孔径太大，无法将分子分离开来。

3. 待测样不能与流动相发生反应，或者样品本身易发生氧化还原等反应。

4. 如果需要做横向对比或者行业类比的，需要指定测试所用的标准品或者测试条件，否则测试结果会出现较大偏差。

5. 样品量需求≥10mg。