激光共聚焦显微镜要点解析（二）

三、激光共聚焦显微镜与光学显微镜之比较

光学显微镜的基本结构主要由机械部分、照明部分和光学部分(反光镜、聚光镜、光圈、目镜、物镜等)组成。激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)则是在20 世纪80 年代推出的高科技产品,其基本结构比光学显微镜要复杂, 它除了包括光学显微镜部分之外, 主要由激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统(包括数据采集, 处理, 转换、应用软件)、图象输出设备、光学装置和共聚焦系统(如光学滤片, 分光器, 共聚焦针孔及相应的控制系统)等部分组成。由此可见, 两种显微镜在构造上最大的区别就在于LSCM 具有结构复杂的计算机系统、激光系统、扫描装置和共聚焦系统。

在光源方面, 由于两者性质的不同, 所成像的清晰度也有明显的区别。光学显微镜的光源大致可分为两类, 一是自然光, 一是内置灯源。可见光经反光镜、聚光镜的作用, 对全视野进行照明, 即场光源, 也就是说它只能对标本局部厚度作平面成像, 这样不仅要求标本为薄切片(5 ～ 10μm), 而且标本上任何一点的图像都会受到邻近点的衍射光和散色光的影响, 降低了图像的反差和分辨率。LSCM 采用单色激光作为光源, 并用附设的小孔光阑-针孔(pinhole)使光源成为点光源, 与光学显微镜的场光源相比, 共聚焦显微镜的点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。LSCM 除了在照明光源前有一个针孔(pinhole)外, 在检测器前方也有一个针孔, 光源针孔和检测针孔的位置相对于物镜焦平面是共轭的,也就是光点通过一系列的透镜最终可同时聚焦于光源针孔和检测针孔, 也就是所谓的“共聚焦” 。光源以激光扫描束的形式形成点光源对样品进行逐点扫描, 通过扫描移动装置使得样品光源照射点始终位于焦平面处, 也就是使样品中不同的扫描点始终在物镜和会聚透镜的光轴上, 其产生的光信号由检测针孔后的光电倍增管逐点接收后, 转变为电信号传输至计算机, 在屏幕上呈现为清晰的整幅焦平面的图象。点光源可通过对样品进行左右、上下的扫描来获得厚标本(可达400μm)不同层面的图像, 亦即可对细胞或组织厚片进行类似CT 断层扫描的无损伤性连续光学切片(optical sectioning), 连续光学切片经计算机三维重建的处理, 能够从任意角度观察标本的三维剖面或整体结构。而传统的光学显微镜即使通过石蜡连续切片等繁琐的步骤也难达到LSCM 在三维重建方面的效果。

光学显微镜的分辨率可用物镜的分辨率来表示,此外, 光学显微镜不仅从焦平面上收集光量, 而且还收集来自焦平面上、下的光量, 使分辨率大大降低。与光学显微镜相比, LSCM 的分辨率除了与光的波长有关外, 主要取决于针孔的直径与物镜的数值孔径。

参考文献：

[1] 李楠, 王黎明, 杨军. 激光共聚焦显微镜的原理和应用[J]. 军医进修学院学报, 1996, 17(3): 1-3

[2] 霍霞. 激光共聚焦显微镜与光学显微镜之比较[J]. 激光生物学报, 2001, 10(1): 1-3