【摘要】 激光共聚焦扫描显微镜是荧光成像领域最重要的表征设备之一，是生物学研究的重要工具。

传统上，为了确定聚合物共混物的形态，通常使用光学显微镜，扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)；但它们也有相当大的缺点。Aref Abbasi Moud[1]介绍了如何共聚焦激光扫描显微镜和拉曼成像可以用来检查单独的聚合物混合物。结果清楚地表明，共聚焦显微镜可以评估纤维、复合材料、混合物和乳液等。共聚焦成像还可用于分析裂缝形成、表面界面动力学和不稳定性、增容、液滴破碎、聚合物共混效率、组分扩散流变学和滑移检测。

 

共聚焦显微镜是一种利用激光和荧光创建材料三维图像的方法。为了在样品的一个点上刺激分子，使用了集中的激光束。荧光是由荧光团恢复到非激发状态时释放的光子引起的；这样，通过在屏幕上扫描样本，就可以形成样本的图像。共聚焦显微镜分为三类：激光扫描显微镜，它提供聚焦光束在样品上成像;旋转圆盘共聚焦显微镜，它使用一个圆盘，上面有螺旋形的针孔；以及可编程阵列显微镜(PAM)，其工作原理与旋转圆盘显微镜相似，但PAM上的针孔可以由用户打开和关闭。所有三种类型的共聚焦显微镜产生图像，然而，旋转盘和PAM系统产生的图像在一个显着更大的帧速率。然而，与激光扫描显微镜不同，它们不支持可定制的采样密度。共聚焦激光扫描显微镜也分为三种主要类型：CLSM、UV CLSM和拉曼显微镜。

 

图1 激光扫描共聚焦显微镜中的光通道。[1]

 

激光共聚焦扫描显微镜是荧光成像领域最重要的表征设备之一，是生物学研究的重要工具。与电子显微镜(如SEM或TEM)相比，CLSM需要相当少的样品制备，并且还兼容3D实时成像。共聚焦意味着从样品深度发出的任何噪声都通过针孔光学地去除。在共聚焦显微镜中，来自样品的光通过显微镜聚焦平面后方的针孔引导，从而提高了分辨率并降低了背景信号。激光扫描还表明，图像是在局部激光激发下逐点捕获的，而不是像传统的宽视场显微镜那样照亮所有样品(CLSM优于传统的宽视场显微镜)。由于激发激光光斑直径在100 nm量级，空间分辨率较低；例如，在大多数共聚焦光谱装置中，两个粒子的共聚焦是低的。另一方面，光学显微镜可以利用可见光激发达到高达200 nm的分辨率。共聚焦显微镜的概念最早是由Minsky在20世纪50年代提出的。Egger和Petran制造了第一台机械扫描共聚焦激光显微镜。

 

图2. 聚丙烯/EVA纯共混物和填充3wt %二氧化硅纳米颗粒的共混物在退火和不退火情况下的CLSM图像。[1]

 

CLSM像扫描电子显微镜一样，用会聚聚焦光束在材料上光栅。当光束通过试样时，集中的光束可以聚焦在板上或试样中。这个聚焦平面可以以微小的增量进行调整，以创建标本的三维图像。保存三维照片后，从任何平面上都可以看到。体元素是可以通过三个坐标来区分的视觉元素。另一方面，法平面图像只有两个坐标，图像的组成部分被称为像素。CLSM的主要前提是通过激光系统和探测器的两个针孔孔从样品的共聚焦位置检测受激光。空间滤光技术可去除失焦光或眩光，从而获得高质量、高分辨率的照片。扫描镜将激光发射的光直接射入样品。二次荧光释放的激光扫描点上的标本返回通过物镜分束器(二色镜)，并集中作为共焦点在探测器针孔孔径。同样的光圈会拒绝由失焦平面反射或发出的光。

 

CLSM和可以分析纤维、复合材料(包括纳米颗粒)、混合物和乳液等。还可用于研究表面界面动力学和不稳定性、增容、液滴破碎、聚合物共混效率、组分扩散流变性和滑移。为了增加表征深度，应将共聚焦成像与声成像和荧光相关光谱模块相结合。

 

[1] Abbasi Moud, A. Polymer blends analyzed with confocal laser scanning microscopy. Polym. Bull 80, 5929–5964 (2023).

 

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