【摘要】 基于检测与荧光标记抗体结合的靶抗原，估计表达分子数量的传统方法假设抗原-抗体反应达到平衡。

基于检测与荧光标记抗体结合的靶抗原，估计表达分子数量的传统方法假设抗原-抗体反应达到平衡。校准程序用于将荧光信号的强度转换成目标分子的数量。随着每个校准系统的不同限制，这实质上限制了传统方法的适用性，尤其是在低亲和力抗体的情况下。我们通过研究来解决这个问题，在研究中，我们展示了一种抗原分子定量问题的新方法。我们没有使用静态校准系统，而是在抗体-抗原结合期间通过流式细胞术分析了平均荧光值随时间的变化。用LSRII血细胞计数器获得的实验数据通过使用Levenberg-Marquardt非线性最小二乘曲线拟合算法的扩散-反应数学模型进行拟合，以获得每个细胞的靶抗原分子的数量。结果与量化BRITE校准系统进行了比较。我们的结论是，可以使用流式细胞术来定量抗原分子，而不是使用实验特异性校准，每个特定抗体-抗原反应的结合速率常数的值。发现了CD8抗体分子结合位点的半径，这允许针对其他条件(不同大小的试剂分子、荧光标记、介质粘度和温度)重新计算结合速率常数。这种方法独立于专门制备的校准珠、抗体试剂和特定染料，并且可以在饱和和非饱和结合条件下应用于低亲和力和高亲和力抗体。该方法在研究稳定结合条件下T细胞上CD8α抗原的人血样数据集上进行了演示。流式细胞术是根据细胞上靶分子的表达水平鉴定细胞群的有力工具。流式细胞仪用户使用感兴趣细胞子集的相对荧光强度(FI)值进行操作，这使得几乎不可能直接比较(在共享对照样品上没有标准化)不同的流式细胞仪，甚至在同一台机器上进行不同的实验。流式细胞仪的设置，在激光和光学对准、光收集、滤光器和光电探测器灵敏度方面(Chance等人，1995年)尚未成功标准化。此外，不同的染料缀合物通常可用于给定的抗体，具有相同荧光染料的抗体制剂因供应商而异，并且样品处理的差异(例如，孵育时间)产生额外的可变性。为了克服这些困难，已经进行了各种努力来定量珠子(或细胞)的FI，即估计表达分子的数量。基于检测与荧光标记抗体结合的靶抗原，估计细胞上表达分子数量的传统方法假设抗原-抗体反应达到平衡，因此结合的量正确报告了细胞上的抗原量。然而，至少需要使用精心准备的试剂进行校准程序，以将荧光信号的强度转化为靶抗原的数量(Serke等人，1998)。例如，在目前上市的技术中，有三种技术是众所周知的:设计用于结合任何荧光染料标记的鼠单克隆抗体的量子简单细胞珠(QSC)(Schwartz等人，1993年)；用于间接免疫荧光的定量免疫荧光强度珠(QIFI试剂盒)(庞斯列等人，1985年)；和量化-BRITE分析(Davis等人，1997年)。尽管基于校准珠的技术似乎是定量荧光流式细胞术的一种简单易用的方法，但这三种技术的现场比较(Serke等人，1998年)揭示了它们的局限性。

QSC基于珠子的数据只有在使用单一的严格一致的方法获得时才具有可比性(Denny等人，1996年；Lenkei等人，1995年)。此外，使用FITC试剂和聚乙烯试剂的QSC分析揭示了细胞结合位点的显著不同的估计(Serke等人，1998年)。QIFI校准试剂盒的使用受到限制，因为它是与单一制造商定义的荧光抗体一起销售的。反过来，Quanti-BRITE分析被指定仅使用特别制备的等摩尔(1个抗体分子:1个PE分子)试剂。一般来说，这些方法不适用于低亲和力抗体的标记和/或非平衡条件下的标记。校准品、荧光染料缀合物和样品处理细节的选择会影响珠或细胞上抗原浓度的测定。如果靶位点非常易移动(即细胞膜上位点的表面扩散比配体分子在介质中的三维扩散快)或彼此足够接近(即位点之间的距离等于或小于位点的半径)以使一些IgG抗体能充分结合，则有效抗体结合位点的数量将低于靶抗原的数量。这是上面提到的基于抗体的方法和这里介绍的方法的一个共同限制，需要特殊的方法来解决这个问题，如单价抗体。我们之前表明，抗原-抗体相互作用的流式细胞术数据可以作为细胞荧光谱的时间演变进行分析，以获得表面抗原的细胞分布信息，以及每个抗原的结合和解离速率常数(奥尔洛娃等人，2011年；Surovtsev等人，2000年)。在这里，我们进一步开发和优化了一种在珠子和细胞上进行抗原定量的动力学方法，该方法可以在饱和和非饱和结合条件下应用于低亲和力和高亲和力抗体，并且独立于缀合的荧光染料。从我们2011年的工作(奥尔洛娃等人，2011年)向前迈出的主要一步是，现在，我们不再使用静态校准系统，而是仅通过流式细胞术分析感兴趣人群的平均荧光动力学，以评估表面抗原的数量。用LSRII血细胞计数器获得的实验数据由稳定结合条件的扩散-反应数学模型拟合(应用于低亲和力和高亲和力抗体的一般情况的解决方案在(奥尔洛娃等人，2011年)中描述)，使用Levenberg-Marquardt非线性最小二乘曲线拟合算法，以获得每个珠子/细胞的靶抗原数量。因此，我们证明了每个特定抗体-抗原反应的结合速率常数可以用来代替校准品，以便用流式细胞术定量每个细胞的抗原分子。在稳定的结合条件下，我们的方法被证明适用于定量人类T细胞上CD8α抗原的浓度。

 

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