【摘要】 培养物孵育两天，使用自动菌落计数器或手动记分。TK6 MN屏幕采用既定方法对TK6细胞进行MN筛选每种提取物的10种浓度，以及阳性和对照，在单培养中使用S9处理4小时（4/40 +S9）和不使用S9处理27小时（27-S9）进行评估。

评估无烟烟草制品的潜在细胞毒性和遗传毒性对体外测试提出了独特的挑战。每种产品都是植物物质的复杂混合物，并且可能包括包装成分作为最终产品的一部分。因此，这些产品以类似于包装产品或医疗器械的方式进行评估-用各种流体孵育以提取应用于测试系统的可浸出成分。

 

此外，个别提取物成分可能是稀释的和/或无害的，需要大剂量来检测任何效果。Hurtado等人[1]在这里报告了验证样品制备、基本处理和处理参数，用于体外测试电池，包括细菌反向突变（Ames）试验、TK6细胞的体外微核和中性红色摄取（NRU）细胞毒性试验。

 

试验品及提取两种商业“长切”无烟烟草产品一种是无香料的（UF），一种是冬青味的（WG）在当地便利市场的货架上获得，并根据公布的程序在完全人工唾液（CAS）中提取简单地说，将样品切碎，通过4毫米筛，在CAS中以10% （w/v）悬浮，超声~3分钟，在~37℃下振荡~2小时（-250 rpm），在室温下通过无菌网袋在2500 rpm下离心~15分钟，在室温下在~10,000 rpm下离心~10分钟，通过1.6 um玻璃纤维过滤器过滤，通过0.22 um醋酸纤维素过滤膜消毒，并在约-70℃冷冻保存，直到使用。

 

CAS含有2.7 mg/mL胃粘蛋白III, 0.95 mg/mL KCI，1.4 mg/mL NaCI、0.37 mg/mL CaCl2 2H20、0.84 mg/mL K2HPO4、0.21 mg/mL MgCl2-6H2O、0.09 mg/mL尿素、0.20 mg/mL D-（+）-葡萄糖、100U/mL a-淀粉酶、0.75 U/mL溶酶、0.004 U/mL酸磷酸酶。艾姆斯屏幕在存在和不存在外源代谢激活系统（+S9;Aroclor 1254诱导大鼠肝脏匀浆（加入适当的缓冲液和辅助因子），采用液体预孵育方法（图1）每个菌株的重复培养用不同稀释的提取物用200-uL剂量体积处理。

 

培养物孵育两天，使用自动菌落计数器或手动记分。TK6 MN屏幕采用既定方法对TK6细胞进行MN筛选每种提取物的10种浓度，以及阳性和对照，在单培养中使用S9处理4小时（4/40 +S9）和不使用S9处理27小时（27-S9）进行评估。每种提取物和CAS对照均被评估至10% （v/v，最终），这是该试验的最大可行剂量。

 

另外一个CAS对照以1% （v/v）评估任何可能的不良载体效应。27小时处理-S9在处理结束时收获培养物，4小时处理+S9在44小时（即40小时恢复期后）收获培养物。细胞毒性是根据相对种群加倍（RPD）的减少来确定的。每种提取物的三个最高浓度，CAS对照（1和10%，v/v）和每种阳性对照的一个浓度，对微核进行评分（400个细胞/培养作为筛选标准;根据RPD选择剂量水平）。

 

NRU屏幕在BALB/c 3T3细胞（克隆A31，从ATCC获得）中使用既定方法进行NRU筛选每种提取物在浓度高达1% （v/v，终值）的重复板中进行评估，而阳性对照（十二烷基硫酸钠;在单个板上同时评估每个实验的SLS）。处理时间为48小时，之后用PBS洗涤细胞，用中性红染色3小时，再次洗涤，并用解吸液提取染色。在-540 nm光密度下测定活力。在初始试验中同时评估UF和WG，并在第二次试验中重新评估UF（由于在第一次试验中一个复制板中存在不可接受的载体控制变异性）。

 

两种商业无烟烟草产品（一种是调味的，一种是无调味的）被切碎并筛选，然后根据公布的程序在人工唾液中超声提取。如图1Ames筛选的初步结果（使用测试菌株TA98和TA100±S9，预孵育处理，剂量量高达200 μ L/板）显示:200 μ L/板剂量时，调味产品具有中度至重度细胞毒性;在最高剂量水平下板的变色（不干扰自动评分），图2中两种提取物在TK6 MN中的检测结果。

 

在这些条件下，两种提取物都缺乏诱变性。使用尼古丁作为替代标记物的初步结果表明，提取物在-70℃下至少稳定一个月。更多的实验正在进行中，以进行全面的分析，并对其他风味标记或烟草成分进行鉴定。萃取和处理参数成功地用于这些体外试验，这些体外试验通常用于评估电子烟、电子烟和可燃香烟凝聚物。

 

在目前评估的条件下，提取物是非遗传毒性的，通常也是非细胞毒性的（但MN评分仍在进行中）。只需要修改检测范围（即测试菌株，重复数，处理条件），并添加先前验证的分析化学终点，以用于提取物的稳定性和表征。

 

图1 Ames筛选结果均为阴性

 

图2 两种提取物在TK6 MN中的检测结果

 

 

[1]. Stankowski, L. F.;  Hurtado, S. B.;  Lallier, B.;  Tydrick, C.;  Liu, Z.;  Gump, J.;  Biswas, K.; Kwok, V. Y., Validation of an In Vitro Test Battery to Evaluate Smokeless Tobacco Products. Environ. Mol. Mutagen. 2018, 59, 103-103.

 

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