【摘要】 低温透射电镜虽然具有启发性和强大的功能，但也是一种要求很高的“专家”技术，需要大量的实践和对原理的深刻理解。

直接成像低温透射电子显微镜（cryo-TEM）已成为研究纳米结构液体的中心方法。首先，它以1-2纳米的分辨率直接公开了组成该系统的基本结构元件。对于许多系统来说，这种在超分子水平上的直接信息是可感知的，并且不需要进一步的图像处理。此外，与其他体积方法（如依赖于模型和探针平均特性的散射）不同，低温TEM图像提供了特定于聚集物的信息。这对于具有不同形态、尺寸或复杂内部秩序的多个结构共存的系统尤其有利（图1）。

 

因此，一个强大的策略是从图像中构建结构的基本物理模型，并将其作为通过间接方法进行定量分析的起点。低温透射电镜也有效地应用于研究时间相关过程（图1）。捕获亚稳和短命中间体的能力通常是理解和证明自组装机制和复杂结构的关键。

 

图1 玻璃化样品的冷冻TEM快照对应于样品的水合、体积状态，直接暴露出共存的形态、复杂的内部秩序和亚稳的中间体

 

低温透射电镜虽然具有启发性和强大的功能，但也是一种要求很高的“专家”技术，需要大量的实践和对原理的深刻理解。最后对介导分裂和融合的膜形成蛋白进行了综述，展示了直接成像冷冻透射电镜在生物学结构-功能研究中的应用。

 

在化学固定中，样品滴被吸附在碳支撑的膜上，用滤纸吸干多余的溶液，并通过添加化学物质固定样品，通常是重金属盐溶液，最常见的是乙酸铀酰或钼盐。最后，Carlo等人[1]对样品进行空气干燥，并在室温下在TEM中进行检查，这种方法被称为阴性染色，具有高对比度，易于执行且价格低廉。

 

然而，负染色不适用于具有复杂相行为的系统，许多纳米结构液体也是如此，因为蒸发和/或温度变化导致不受控制的结构和相转变。阴性染色可用于许多生物大分子复合物的典型稳定组装，但染色限制了分辨率并掩盖了精细的结构细节，而且染色-样品相互作用、染色和干燥引起的pH变化仍可能产生一些影响（图2A）。低温TEM涉及物质状态的变化——从流体到玻璃态——但不添加外来化合物，只对本体条件、成分或结构产生最小影响。这是通过超快速冷却实现的，该冷却将流体悬浮液的薄膜转化为玻璃化（无定形）的低蒸气压试样（图2B）。Uhlmann等人[2]研究得出需要数百度（毫秒）的高冷却速率来保存原始纳米结构，防止溶剂结晶和相关的光学伪影、机械损伤以及溶质及其空间组织的重新分布（图2）。这些冷却速率是通过最大化样品的表面积与体积比和使用适当的冷冻剂来获得的。

 

手动和自动设备中的印迹的确切量及其模式必须根据流体的性质进行调整。建议在玻璃化前将印迹样品松弛15–60秒，以克服可能的剪切效应（图2C），如物体排列，甚至（尽管明显不那么频繁）结构转换。由与印迹相关的复杂流动模式引起的其他影响，如根据尺寸的结构分离，是不可避免的。尽管低温TEM可以捕获多个长度尺度的组件，但在印迹过程中，偶尔会从样品中排出微米大小的结构。

 

图2 冷冻透射电镜标本的基本特征以及与阴性染色的比较

 

[1] De Carlo S, Harris JR. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron 2011;42(2):117-31.

[2] Uhlmann DR. A kinetic treatment of glass formation. J Non-Cryst Solids 1972;7(4):1972.

 

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