【摘要】 由于缺乏关于抗生素、ARB和ARG污染可接受水平的明确指南，因此需要设计在环境样本中对其进行量化的测定方法，以防止ARB的传播。

抗生素耐药现象是21世纪人类健康面临的最大问题之一。控制抗生素耐药基因（ARGs）在环境中的传播是保证这些重要药物治疗能力长期存在的关键挑战。抗生素化合物一旦释放到环境中，就会引起抗生素耐药细菌（ARB）的富集，即使在亚抑制浓度下也是如此。

 

因此，由于ARB的广泛传播、ARGs的增殖以及其通过水平基因转移的潜在动员，需要可靠地确定其发生和丰度，以提高对其在环境热点地区动态的认识。污水处理厂（WWTPs）由于对抗生素浓度高的废水管理或处理效率低下，是ARGs的重要储藏库，导致ARGs和ARB向接收水体传播。

 

由于缺乏关于抗生素、ARB和ARG污染可接受水平的明确指南，因此需要设计在环境样本中对其进行量化的测定方法，以防止ARB的传播。

 

Lizandra Perez‑Bou1等人[1]开发的分子工具和新的qPCR方案使用从不同环境样本中提取的DNA进行了验证，包括活性污泥、河流沉积物和农业土壤，这些生态系统之前被描述为目标ARGs传播的热点和ARB的环境水库。

图1 使用的工作流程图用于设计和验证新的ARGs qPCR定量引物对。

 

图2 6个环境样品中ARGs的总丰度通过两次独立的qPCR反应以环境样品的基因拷贝数/g确定（n=18）。

 

在QuantStudio-3 Real-Time -PCR系统（Applied Biosystems， USA）上对环境样品中的目标ARGs进行qPCR定量，反应条件与传统PCR“优化PCR热循环谱和构建qPCR定量ARGs的质粒标准”章节相同，采用syr -Green I （0.125 μL, 20×SYBR Green I (Thermo Scientific， USA)）作为染料法进行实时荧光监测。

 

将含有目标基因的线性化质粒在108 ~ 10拷贝/μL范围内连续稀释，构建绝对定量标准曲线。本研究采用的一般工作流程如图1所示。

 

开发新的qPCR方法需要检测和量化来自不同环境样本的复杂DNA中给定种群的实际发生情况，包括罕见的，神秘的和难以捉摸的基因[34]。

 

为此，在六个自然和工程环境样本中验证了引物的效率、qPCR条件和不同基质的效果，以显示符合新引物设计验证和新开发的qPCR方法建立需要解决的关键考虑因素的正确水平。

 

研究检测到的ARGs总丰度如图2所示。所有样本中均存在aadA、aadB、blaTEM、dfrA1和fosA基因。另一方面，ampC、blaSHV、ermB、qnrS和tetA(A)基因仅在部分样本中检测到，表明这些ARGs在分析的不同环境中是罕见的。

 

最后，在所有样品中均未检测到mecA基因。结果表明，除mecA基因外，采用本研究提出的de novo引物组和qPCR方法在环境样品中发现了较高的ARGs检测频率（70% ~ 100%）。

 

在自然和工程生态系统中，最常用的抗生素（β -内酰胺类抗生素、氟喹诺酮类抗生素、四环素类抗生素、大环内酯类抗生素和磺胺类抗生素）的ARGs的广泛发生和普遍分布已被确定为一个严重的公共卫生问题，这一事实被广泛归因于到达这些生态系统的抗生素浓度低于最低水平。

 

综上所述，针对aadA、aadB、ampC、blaSHV、blaTEM、dfrA1、ermB、fosA、mecA、qnrS和tetA(A)基因设计了11个新的引物，满足了qPCR引物开发的严格要求，与目前大多数引物相比，提供了改进的设计和更高的覆盖率。

 

新的引物组和qPCR方案的验证显示出目标特异性和高PCR效率、充足的线性动态范围、低LOD和LOQ值的分析灵敏度、可重复性和重现性，即使在携带极低目标DNA浓度的样品中也显示出它们的鲁棒性。在河流沉积物、农业土壤、活性污泥、堆肥和厌氧消化液等环境样品中也成功验证了新引物和qPCR方案的可靠性。

 

ARGs的丰度趋势在不同的样本中存在差异，突出了aadA和ermB基因在所有样本中的患病率。aadA、blaSHV、blaTEM、dfrA1、fosA、qnrS、tetA(A)基因相对丰度较低，mecA基因不存在。

 

特别是，这些ARGs在抗生素耐药性出现中的重要性，加上aadA和ermB基因的高发生率，证实了wwtp作为ARB传播热点的重要性。有效可靠的新qPCR方法的发展对定量arg的丰度做出了突出贡献，并可以提供有关ARB发生的信息，有助于提出减少抗生素耐药性出现的新策略。

 

因此，本研究开发的改良引物集可以作为改善抗生素耐药现象的第一步，被认为是准确监测环境中ARGs的有价值的工具。

 

[1] L. Perez-Bou, A. Gonzalez-Martinez, J.J. Cabrera, B. Juarez-Jimenez, B. Rodelas, J. Gonzalez-Lopez, D. Correa-Galeote, Design and Validation of Primer Sets for the Detection and Quantification of Antibiotic Resistance Genes in Environmental Samples by Quantitative PCR, Microbial Ecology 87 (2024) 71.

 

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