稳定同位素质谱法标记克雷布斯循环中间体的 18O

新技术允许通过指纹代谢物水平来确定人类疾病的代谢组学特征^[1]。然而，为了充分了解代谢组表型，有必要了解代谢物水平和周转率。克雷布斯循环是能量代谢和细胞信号传导的主要枢纽。传统上常用¹³C 作为稳定同位素质谱法标记底物用于追踪克雷布斯循环代谢物中的碳周转率^[2,3]。

在这项研究中，我们首次引入基于 H₂[ ¹⁸O] 的稳定同位素标记，该标记允许跟踪克雷布斯循环的不同部分中的氧交换率。系统地测试了色谱和非色谱参数对克雷布斯循环介质标记比例的影响，以提高方法的选择性和灵敏度。开发了一种快速、精确且稳健的 GC-MS 方法，用于确定 ¹⁸O 掺入克雷布斯循环代谢物的百分比。

该方法用于跟踪癌症诱导的 Caco-2 细胞克雷布斯循环动力学变化，并进行比较对照 FHC 细胞揭示了 Caco-2 细胞中的 Warburg 效应。我们证明，使用这种新开发的 ¹⁸O 标记分析技术，通过跟踪克雷布斯循环代谢物的氧交换率可以获得独特的信息。因此，三羧酸循环代谢物的 ¹⁸O 标记扩展了监测细胞代谢动态的技术库。

此外，所开发的方法将允许将 ¹⁸O 标记技术应用于许多其他与水进行氧气交换的代谢途径。在这里，我们开发了一种新颖的 ¹⁸O 标记技术，可用于测量三羧酸循环代谢物的动态。我们的结果表明，基于 H₂[ ¹⁸O] 的稳定同位素载体 ¹⁸O 标记技术不仅可用于监测传统使用的磷酰基转换，还可用于跟踪克雷布斯循环介质中的氧交换动力学。

确定最佳 ¹⁸O 标记条件和每个代谢物片段的最高 m/z 值，用于计算 ¹⁸O 标记百分比和周转周期。所开发的技术用于测量癌性 Caco-2 细胞中与对照 FHC 细胞相比的克雷布斯循环动力学变化。通过实施我们开发的体内 ¹⁸O 同位素监测方法，无疑将更好地理解定义癌细胞代谢异质性的潜在机制。

同位素标记技术的选择通常取决于实验设计、样品类型和特定的代谢途径。此外，孵化时间也很重要。与需要更长孵育时间的其他技术（³²P、¹³C、¹⁵N）相比，¹⁸O 标记可以在几分钟内完成。这使得应用和重复实验在所需水平上变得容易。因此，三羧酸循环代谢物的 ¹⁸O 标记扩展了监测细胞代谢动态的技术库。

未来，¹⁸O标记技术可应用于许多其他与水进行氧气交换的代谢途径。通过这种方式，可以通过代谢物的周转率来比较不同系统的动态代谢组学分析，并获得有关疾病机制、诊断和治疗潜力的详细而独特的信息。

[1] W.B. Dunn, et al., Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry, Nat. Protoc. 6 (7) (2011) 1060e1083.

[2] E. Nemutlu, et al., 18O-assisted dynamic metabolomics for individualized diagnostics and treatment of human diseases, Croat. Med. J. 53 (6) (2012) 529e534.

[3] A. Cornish-Bowden, M.L. Cardenas, From genome to cellular phenotype – a role for metabolic flux analysis? Nat. Biotechnol. 18 (3) (2000) 267e268.

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