【摘要】 研究人员使用不同类型的检测方法来筛选主要针对癌症细胞的已开发治疗方法的结果。
细胞活力是指某一群体中活细胞的数量,测量增殖细胞的数量被用作细胞对药物或化学制剂的存活或死亡作用的重要指标。药物的作用可以分为细胞毒性,即具有毒性并杀死细胞,也可以分为抑制细胞生长。对于不同类型的生物学研究,检测特定群体中的活细胞数量是很重要的。细胞毒性和增殖测定基本上用于筛选细胞对药物或任何化学试剂的反应。
特别是制药工业广泛使用细胞毒性测定来确定所开发的试剂对细胞的影响。研究人员使用不同类型的检测方法来筛选主要针对癌症细胞的已开发治疗方法的结果。有多种方法可以检测不同化合物的细胞毒性和细胞抑制作用,并测量细胞活力。不同的方法可以依赖于各种细胞功能,包括细胞膜通透性、染料摄取、代谢活性、酶释放、细胞粘附、ATP产生、共酶产生、DNA合成和核苷酸摄取活性。主要和常见的细胞增殖和细胞毒性检测方法分为不同的类别。
MTT测定基于活细胞中释放的线粒体NAD(p)H依赖性氧化还原酶将MTT转化为不溶性甲晶体(图1)。这些线粒体酶具有在某些细胞培养条件下通过还原反应将MTT转化为不溶性甲酰胺的能力。
MTT分析基本上使我们通过测量线粒体活性来确定活细胞的数量,线粒体活性与甲zan晶体的数量有关。增殖细胞具有较高的MTT转化反应速率,而死亡或生长缓慢的细胞具有较低的代谢,导致较低水平的MTT减少。
MTT应用后,用溶液如二甲基亚砜或洗涤剂十二烷基硫酸钠溶解甲zan晶体。因此,甲氮浓度可以通过分光光度计在540至720 nm之间进行测量[3,4]。MTT测定法最常见的用途是检测不同试剂在不同条件或不同浓度下的细胞毒性作用。
Berridge等[1]通过比较对照组和用药组的生存能力来检测用药的IC50值(50%最大抑制浓度)。MTT法适用于潜在药物的体外试验,也适用于研究细胞系中的耐药性。它也有助于确定药物在体外的作用和预测临床应用。另一方面,它不便于后续研究,因为它需要在方案期间杀死所有细胞。通过这种方法也不可能区分细胞毒性和细胞抑制剂,当细胞数量较低时,结果也不正确。
图1 MTT测定,线粒体NADH通过脱氢酶转化为NAD+
乳酸脱氢酶释放测定法最早是为了测定免疫细胞的细胞毒性而开发的。LDH是一种可溶性细胞质酶,在坏死或凋亡细胞的膜破裂后释放到细胞培养基中。因此,可以测量LDH活性来检测不同药剂或环境因素的细胞毒性作用。LDH测定包括测量细胞培养基中LDH活性水平的两步程序。在第一步中,LDH通过将NAD+还原为NADH来催化乳酸盐转化为丙酮酸盐。
然后,在该步骤之后,通过使用生成的NADH的一水硬铝酶将四唑鎓盐(INT)还原为红色甲zan产物(图2)最后,用分光光度计在490-520nm处对所出现的四氮唑盐进行了比色测定。因此,甲赞形成的水平与介质中释放的LDH的量成正比。培养基中的LDH水平可能被内源性LDH活性污染,并导致假阳性结果,Wolterbeek等[2]证明该方法需要额外的确认。尽管这种方法被广泛使用和接受,但LDH在培养基中的半衰期有限,LDH测定的灵敏度也有限。
图2 LDH释放测定
[1] Berridge, M.V.; Herst, P.M.; Tan, A.S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnol. Ann. Rev., 2005, 11, 127-152.
[2] Wolterbeek, H.T.; van deer Meer, J.G.M. Optimization, application, and interpretation of lactate dehydrogenase measurements in microwell determination of cell number and toxicity. Assay Drug Dev. Technol., 2005, 3(6), 675-682.
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