【摘要】 图像细胞术以前已经证明改进了基于细胞的测定，如转导效率，细胞增殖和细胞杀伤测定。

转基因T细胞(CAR)-T细胞疗法目前正在彻底改变癌症免疫治疗领域。T细胞被设计成表达含有单链可变抗体片段(scFv)的CAR，其与包括CD3ζ(z)激活结构域(第一代)，具有CD28或41BB共刺激结构域(第二代)或两者(第三代)。当肿瘤抗原与CAR结合时，细胞内信号结构域诱导T细胞活化，导致CAR-T增殖，细胞因子释放和肿瘤细胞以抗原依赖性方式杀伤。

 

自2010年首次报道抗CD19CAR-T细胞治疗B细胞恶性肿瘤的治疗以来，该领域显着扩大，免疫肿瘤学研究人员正在努力将这种细胞疗法应用于包括实体瘤在内的许多不同癌症类型。最近FDA批准这种新型细胞免疫疗法引入主流癌症治疗，这进一步促进了CAR-T细胞发育的增加，具有更大的功效和安全性概况。

 

CAR-T发现过程由多个部分组成:鉴定可以特异性靶向在癌细胞上过表达的肿瘤相关抗原(TAA)的CAR候选物，瞬时转染或活化的T细胞的稳定转导以诱导CAR表达，随后是CAR-T细胞扩增以及功效和安全性评估。目前，Kymriah和Yescarta以及许多临床试验CAR-T细胞是由慢病毒或γ-逆转录病毒转导产生的。利用多种技术和检测方法来完成CAR-T发现过程中所需的一系列逐步评估。

 

然而，这些方法很难以高吞吐量的方式筛选CAR候选者。CAR-T细胞转导效率通常使用流式细胞仪测量，每个样品可能需要2分钟，导致每个平板大约2-3小时，包括热身和清洁程序。

 

因此，流式细胞术不是一种实用的方法来进行高通量和及时的测量。此外，用于流式细胞术的珍贵CAR-T细胞样品不能用于下游测定。最后，传统上使用51Cr释放测定法测量CAR-T效力，这是放射性危害，需要大量的靶细胞和效应细胞，并且仅通过上清液间接测量细胞死亡。

 

图像细胞术技术在过去的十年中已经取得了重大的进展，从单一样本测量到高通量的基于平板的分析。图像细胞术以前已经证明改进了基于细胞的测定，如转导效率，细胞增殖和细胞杀伤测定。一般来说，该系统能够在不到5分钟和10分钟的时间内分别利用亮场和荧光对整个96孔板进行成像和分析。

 

因此，测定转导效率、细胞增殖和细胞杀伤的时间可以显著减少。需要的效应细胞大约少20倍，这在处理有价值的样品时非常有利。由于图像细胞术可以直接测量细胞在板，细胞不受干扰，可以在多个时间点监测。此外，细胞图像保存和查看，因此可以验证分析，以消除不确定性。

 

在此，我们展示了图像细胞术的应用，以执行CAR-T发现的关键细胞为基础的分析，并简化了这一过程。首先，利用图像细胞术测量CAR-T细胞转导效率和增殖，其中转导效率直接与流式细胞术进行比较以进行验证。

 

接下来，使用图像细胞术在表达CAIX的人透明细胞肾细胞癌(ccRCC)SKRC-59细胞上用先前报道的抗CAIXg36-CD28CAR-T细胞进行直接肿瘤细胞杀伤测定，并与51Cr释放进行比较。最后，使用抗CAIXG36-CD28CAR-T细胞和使用图像细胞术共培养CAIX阳性和CAIX阴性SKRC-59细胞进行选择性肿瘤细胞杀伤测定，并与流式细胞术进行比较。

 

每个实验的结果在图像细胞术和相应的常规方法之间具有可比性，这验证了图像细胞术在CAR-T发现分析中的应用。此外，利用图像细胞术技术所带来的优势，提高了数据采集的效率，生成了时间过程数据，显着减少了每次检测的时间，提高了一致性，降低了样品浪费。所提出的图像细胞术方法可以提供流线型CAR-T发现过程，其中以最小的破坏和直接分析从产生到体外功能测定的CAR-T细胞板。

 

1.Wang, Y., Chan, L.L.-Y., Grimaud, M., Fayed, A., Zhu, Q. and Marasco, W.A. (2021), High-Throughput Image Cytometry Detection Method for CAR-T Transduction, Cell Proliferation, and Cytotoxicity Assays. Cytometry, 99: 689-697. https://doi.org/10.1002/cyto.a.24267.

 

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