【摘要】 在不改变反应混合物或额外添加酶的情况下，可以同时实现双信号放大。

抗生素耐药基因（ARGs）存在于生物体中，由表达不同蛋白酶的特定基因编码，以代谢抗生素并使抗生素无效。各种环境媒体，包括河水、生活污水、污水处理设施、农场、池塘和湿地。

 

与许多化学污染物不同，ARGs可以在整个环境或宿主体内传播。ARGs不仅可以通过垂直基因转移在宿主微生物中传播，还可以通过水平基因转移传播，提高致病菌的抗性。为了准确评估ARGs在环境中的传播，必须尽快开发一种快速、简单和负担得起的检测方法。

 

Wang等人[1]设计了一种新型SERS传感器，结合双循环放大策略，显著提高了对痕量ARGs的检测灵敏度。作为广泛分布的ARGs之一，具有26个碱基代表性基因片段的bla-TEM被选择作为本概念验证研究的模态分析物。提出的分析方法包括富集、信号放大和SERS检测。

 

在富集过程中，bla-TEM被磁珠（MB）表面的识别DNA链（DNA-1）和基于Hg2+适配体的捕获链（DNA-2）捕获，然后进行磁分离富集。因此，获得的bla-TEM与复杂样品分离，有效地避免了基质干扰。

 

在扩增过程中，基于Hg2+适配体的捕获链发生缺口/聚合扩增，获得累积的触发DNA链。为了实现双信号放大，将另一个发夹（DNA-3）作为捕获的DNA修饰到MBs表面。

 

同时，将拉曼信号分子标记的识别DNA （DNA-4）和信号DNA （DNA-5）共同修饰在金纳米颗粒（AuNPs）表面，作为SERS探针。DNA-3的发夹结构被释放的触发链打开，然后与DNA-4杂交。在聚合酶和缺口酶存在的情况下，缺口/聚合过程发生，触发链再次释放。

 

因此，在不改变反应混合物或额外添加酶的情况下，可以同时实现双信号放大。在检测过程中，将MBs表面富集的SERS探针与反应溶液进行磁分离，然后采样到拉曼光谱仪中。在激光激发下，利用拉曼信号可以对bla-TEM进行定性和定量分析。

 

由于采用SERS方法和核酸信号扩增技术，所建立的检测方法具有灵敏度高、LOD可达0.02 zM、操作简便、室温反应快速（分析时间在60 min以内）、在实际环境样品中成功应用等明显优点。

 

图1 (a)合成AuNPs的粒径分布（插图：合成AuNPs的TEM图像）；(b) SERS探针的粒度分布（插图：获得的SERS探针的TEM图像）；(c)捕获DNA、ROX-DNA、AuNPs和SERS探针的紫外可见光谱。

 

图2 磁性SERS传感器结合双循环放大检测痕量bla-TEM的原理图。

 

图3 (a) pH的影响；(b)反应温度；(c) KF聚合酶的浓度；(d) 刻蚀酶浓度对拉曼强度的影响。bla-TEM的使用浓度为1am。

 

AuNPs和SERS探针的透射电镜图如图1所示。分散良好的AuNPs呈纳米球形，直径约为15.38±1.41 nm（图1a）。经DNA修饰后，得到的SERS探针尺寸略有增加，为16.87±1.40 nm（图1b）。如图1c所示，获得的SERS探针显示出DNA和AuNPs的特征吸收峰，证实了SERS的成功制备。

 

图2概述了环境样品中痕量bla-TEM检测的检测分析，包括富集、扩增和检测过程。利用生物素与链亲和素的强亲和力，将识别DNA链（DNA-1）修饰到MB的表面。通过T-Hg2+ T配对，DNA-2形成了发夹结构。通过碱基配对，样品中的ARGs和相应数量的发夹DNA-2可被MBs-DNA-1捕获。

 

由于pH和温度是影响DNA杂交和酶活性的两个关键因素，因此首先研究了它们的作用。如图3a所示，随着pH的升高，SERS强度增加，并在pH= 7.4时达到峰值。

 

因此，后续实验选用pH= 7.4。在25℃、30℃、35℃、37℃、40℃和45℃不同温度下SERS强度的变化如图3b所示。当温度从25℃升高到37℃时，SERS强度呈现相应的增加趋势。然而，当温度超过37℃时，SERS强度开始下降，因为温度过高会影响酶的活性。

 

综上所述，该研究提出了一种灵敏度超高、选择性好、操作简便的新型SERS传感器，用于环境样品中痕量ARGs的检测。该方法由两条DNA链修饰的MBs、一条基于Hg2+适配体的捕获链和一个SERS纳米探针组成。

 

由于MBs表面的捕获DNA和基于Hg2+适配体的捕获链具有良好的识别能力，目标ARG被选择性捕获并通过磁分离富集。然后，将捕获的ARG在聚合酶、缺口酶和SERS纳米探针的辅助下进行双核酸信号扩增检测。

 

可行磁分离后，获得MBs表面积累的SERS纳米探针，用于拉曼检测，实现定性和定量分析。核酸信号扩增实验显示，SERS信号明显增强。此外，富集的检测探针可以通过两次简单的磁分离获得，并且整个扩增过程在等温条件下发生在一个点上，避免了费力的温度变化或分离过程。

 

[1] Q. Wang, C. Jiang, Y. Zhang, M. Li, X. Shi, Y. Zhang, F. Tian, F. Li, L. Ren, S. Zhang, X. Song, SERS sensor combined with the dual DNA cycling amplification assay for the sensitive detection of antibiotic resistance gene in environmental samples, Sensor Actuat B-Chem 396 (2023) 134599.

 

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