流式细胞仪的原理

前言

流式细胞术是一种对快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术，具有检测速度快、测量参数多、采集数据量大、分析全面、分选纯度高、方法灵活等特点，已经成为近代科学研究中的热门专题，研究它的论文数量也在逐年上升。流式细胞仪（flow cytometer，FCM）是以流式细胞术为核心技术，集光学、电子学、流体力学、细胞化学、生物学、免疫学以及激光和计算机等多门学科和技术于一体的先进科学技术设备。它被广泛应用于临床医学、细胞学、生物学、微生物学、制药学、生殖学等领域，是现代科学研究中的先进仪器之一，被誉为实验室的"CT"。

1 流式细胞仪的工作原理和技术指标

1.1 流式细胞仪工作原理

图1为流式细胞仪基本结构。它主要有四部分组成：流动室和液流系统；光源与光学系统、信号收集与信号转换系统、计算机与分析系统。具有分选功能的流式细胞仪还包括分选系统。将待测细胞荧光染色后制成单细胞悬液，在鞘液的包被下单行排列，依次通过流动室检测区域。以激光作为激发光源，垂直照射检测区域的样品流，被荧光染色的细胞在其照射下，产生散射光和激发荧光，它们同时被前向光电二极管和侧向90°方向的光电倍增管接收。前向小角度的光散射信号（forward scatter,FSC）反映了细胞体积的大小；侧向90°方向的光散射信号（side scatter，SSC）反映了细胞内颗粒的复杂情况。激发荧光信号代表了所标记的被测细胞内部颗粒的信息。这些光信号转化成电信号，被传送到计算机，经A/D转换器传输到微机处理器形成数据文件，保存到计算机上，以备脱机后的数据处理和分析。细胞的分选是将待测液滴充以正负不同的电荷，让其在高压电场的作用下偏转，落入不同的收集容器中，从而实现细胞的分离。

图 1 流式细胞仪结构示意图

1.2 流式细胞仪性能的技术指标

流式细胞仪性能的技术指标主要有荧光分辨率、荧光灵敏度、分析参数多少及分析、分选速度及纯度等。荧光分辨率是指分辨两个相邻峰的最小距离，通常用变异系数（CV值）来表示。现在市场上主流型号的荧光分辨率小于2.0%，有的甚至在1%之内。荧光灵敏度反映了仪器探测最小荧光光强的能力，一般用荧光微球上可测出的荧光（FITC）的最小分子数来表示。目前仪器可以达到100以内。一般分析速度为500-10000个细胞/s，分选速度控制在1000个细胞/s以下，分选纯度>98%,有的仪器（如 MoFLo High-Performance Cell Sorter）分析速度可达100000个细胞/s，分选速度可达70000个细胞/s，分选纯度>98%。应用方向不同，分析参数的多少差异较大，少的（如Guava PCA-96）可以分析3个荧光参数和1个散射信号，多的（如CyFlow SL）可以分析13个荧光参数和3个散射信号。

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