【摘要】 通过PI等可以与DNA结合的荧光染料对DNA进行染色，DNA含量越多，激光激发后产生的荧光越强，通过检测荧光强度对细胞处于哪个分裂阶段进行判断。

样本上机前处理方式（以流式周期实验为例）

1、收集细胞：弃去上清，加入1 ml PBS清洗一次，弃上清，再加入1 ml 0.25%胰酶消化细胞，待细胞变圆且有部分细胞悬浮，即加入PBS终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮。细胞悬液转入离心管中，1500 rpm离心5 min收集细胞。

2、PBS洗涤细胞：加入3 ml 4℃预冷的PBS完全重悬细胞，1500 rpm离心5 min，弃上清。沉淀震荡混匀。

3、固定过夜：沉淀中缓慢加入-20℃预冷的75％乙醇，重悬细胞，4℃过夜。

4、PBS洗涤细胞：加入2 ml PBS混匀后，1500 rpm离心5 min收集细胞，PBS重悬，离心收集细胞。加入100 ul PBS重悬细胞。

5、去除RNA：加入2 μl 浓度为1 mg/ml 的RNaseA（去离子水配制），37℃水浴40 min。

6、荧光标记：加入100 µl浓度为100 µg/ml 的PI染色液（PBS配制），避光染色20 min。

7、上机检测：流式细胞仪使用激发波长488 nm，发射波长585±21 nm进行检测，用flowj软件分析细胞周期以确定细胞周期分布。

结果展示

1.流式检测细胞周期

通过PI等可以与DNA结合的荧光染料对DNA进行染色，DNA含量越多，激光激发后产生的荧光越强，通过检测荧光强度对细胞处于哪个分裂阶段进行判断。

2.流式检测细胞凋亡

Annexin V 与 PI 匹配使用，可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来：PI 被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被 FITC 和 PI 结合染色呈现双阳性(Annexin V+/PI+)。

3.流式检测ROS

不发光的2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠（DCFH-DA)为ROS捕获剂，可迅速通过细胞膜进入细胞，在细胞内酯酶作用下脱去二酯生成不发光的DCFH,而DCFH不能通透细胞膜。

.4.流式检测线粒体膜电位

线粒体跨膜电位下降是细胞凋亡早期的标志性事件，JC-1染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱表征线粒体内膜电负性的增高或降低。

5.免疫表型分析

表型就是某种细胞或者细胞亚群表达一些重要的抗原分子的情况，明确细胞表达这些抗原分子的情况就能从一定程度上判断这群细胞的某些特征，而且也可以从一定程度上判断这群细胞的功能状态。

 

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