【摘要】 介绍了一种基于溶液中点击化学的自旋标记策略，该策略与酶连接相结合，可以高效地标记复杂和长的 RNA，反应时间短，并抑制 RNA 降解。

定点自旋标记是研究 RNA 等生物大分子的构象和动力学的有力工具。在这里，介绍了一种基于溶液中点击化学的自旋标记策略，该策略与酶连接相结合，可以高效地标记复杂和长的 RNA，反应时间短，并抑制 RNA 降解。通过这种方法，可以在多个位置用两个标记来标记 preQ1 核糖开关的 34 核苷酸适体结构域和 81 核苷酸 TPP 核糖开关适体。然后我们表明，在 Mg2+ 和 preQ1 配体不存在和存在的情况下，可以通过室温下的连续波电子顺磁共振光谱和在室温下的脉冲电子-电子双共振光谱（PELDOR 或 DEER）来监测 preQ1 适体的构象及其动力学。

 

图 1. (a) preQ1 dŲ 32 和 (b) preQ1 dŲ 4-dŲ 32 (G11A) 在没有 preQ1 和 Mg2+（红色）的情况下添加 Mg2+（黑色）后的室温 CW X 波段 EPR 光谱，以及添加 Mg2+ 和 preQ1 后（蓝色）。信号强度标准化为中心峰高。用星号标记的峰是由于管玻璃中存在杂质造成的。在没有 preQ1 和 Mg2+ 的情况下、添加 Mg2+ 后以及添加 preQ1 后，(c) preQ1 dŲ 32 和 (d) preQ1 dŲ 4-dŲ 32 (G11A) 的实验（红色）和计算（黑色）CW EPR 光谱在室温下。计算出的光谱由具有不同迁移率的两种贡献组成：迁移率较高（蓝色）和迁移率较低（绿色）的自旋标签。条件：cpreQ1 dŲ 32 = 100 μM，cpreQ1 dŲ 4-dŲ 32 (G11A) = 50 μM，10 mM 二甲胂酸盐缓冲液； cMg(II) = 2 mM，cpreQ1 = 1.2 mM。.【1】

 

所有标记的 preQ1 核糖开关构建体在室温下均显示 CW X 波段 EPR 光谱，这是部分固定化硝基氧的典型特征，并且没有显示游离标记存在的证据。自旋计数揭示了定量自旋标记。

 

例如，三个 preQ1 dŲ 32 样品（单独的 preQ1 dŲ 32、含有 Mg2+、以及含有 Mg2+ 和 preQ1 配体）的 CW EPR 光谱如图 1a 所示（对于其他样品，请参阅支持信息）。三个光谱中的每一个都是两个光谱的叠加，一个光谱宽度较宽，在低场位置产生宽肩，另一个光谱宽度较窄，主要形成三个强线。仅改变旋转相关时间 τc 和两个光谱的比率，但使用相同的参数，否则可以模拟两个光谱。

 

图 1 显示了与实验光谱重叠的最佳拟合模拟 EPR 光谱。较窄的光谱对应于 τc 为 0.7 ns 的更易移动的硝基氧标记（图 1，蓝线），而较宽的光谱对应于 τc 为 6.3 ns 的更固定的标记（图 1，绿线）。在没有 Mg2+ 和配体的情况下，可移动物质的比例为 71%，较固定物质的比例为 29%。添加 Mg2+ 后，移动物质的比例减少至 37%，添加配体后进一步减少至 19%。

 

同时，添加 Mg2+ 和配体后，固定物质的比例分别增加至 63% 和 81%。通过溶液中的点击化学，以前所未有的效率完成了 preQ1 和 TPP 核糖开关的自旋标记。新的自旋标记策略显着缩短了反应时间，提高了标记效率，并在自旋标记过程中显着抑制了 RNA 降解。对于 preQ1 核糖开关，构象平衡和假结形成可以通过 CW EPR 和 PELDOR 测量来监测。

 

通过 preQ1 dŲ 4-dŲ 32 (G11A) 突变体的 EPR 和 PELDOR 测量证实了 preQ1 核糖开关的构象变化与 EPR 和 PELDOR 结果之间的相关性。自旋标记策略的应用已扩展到无法在固体支持物上大量合成的大型 TPP 核糖开关。距离测量表明，即使在游离状态下，TPP核糖开关也存在两种稳定构象。因此，CW EPR 和 PELDOR 与通过点击化学进行的 RNA 定点自旋标记相结合，非常适合研究大功能 RNA 的构象动力学。

 

【1】Mark Kerzhner, Hideto Matsuoka, Christine Wuebben, Michael Famulok, and Olav Schiemann High-Yield Spin Labeling of Long RNAs for Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy Biochemistry 2018 57 (20), 2923-2931 DOI: 10.1021/acs.biochem.8b00040

 

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