【摘要】 负染色法提供了一种简单且有用的分析工具，用于识别致密纤维的缺陷并对其进行量化。

由于尾部缺陷导致的运动障碍在临床男科中很常见。应根据鞭毛的形态来评估精子活力。由于常规透射电子显微镜 (TEM) 很少能获得合适的纵向切片，并且考虑到致密纤维在调节精子活力和提供拉伸强度方面的重要性，因此尝试通过负染色和 TEM 对人类精子鞭毛进行详细研究。该研究在两组男性中进行：（I）有生育能力的男性和（II）弱精子症男性。研究表明，外部致密纤维延伸至主片的 50-60%。在 I 组和 II 组中，分别有 83% 的精子和 23% 的精子可见正常致密纤维。观察到的特征是直径变化、破损或退化，端件缺失或延长。

 

图 1. (A) 人类精子负染色的低倍视图 (x 670)。 (B) 通过负染色观察正常精子的椭圆形头部、中段和主段 (x 1100)。 (C,D) 结构性轴缺陷，外部致密纤维和纤维鞘破裂，轴丝保持完整 (C x 10,000；D x 6700)。 (E) 人类精子尾部正常主片（近端）的低倍和高倍放大电子显微照片（x 6700；x 14,000）。 (F) 人类精子异常主片的低倍和高倍电子显微照片，其中外部致密纤维缺失，轴丝清晰可见（x 6700；x 14,000）。 (G) 通过负染色观察到的人类精子尾部的正常末端片段 (x 2400)。 (8) 人类精子尾部的异常末端显示尾部的膜状延伸 (x 2400)[1]

 

负染色法提供了一种简单且有用的分析工具，用于识别致密纤维的缺陷并对其进行量化。

 

看到足够数量的合适的纵向截面以进行定量比较(图1A)。内部结构的走向和延伸可以很容易地研究。研究表明，外部致密纤维延伸至主片的 50-60%（图 IB）。在 I 组中，83% 的样品中可见到正常致密纤维，而在 II 组中，仅 23% 的样品中可见到正常致密纤维。外部致密纤维的紊乱可以很容易地通过异常染色模式来表征。主片的正常致密纤维可以被视为均匀的深色染色带（图IE），而在异常主片中看到的特征是断裂或降解、畸形或缺失的致密纤维（图1C、D、F）以及变化直径和表面不规则性。

 

图 2. (A,B) 负染色显示人类精子头部顶体区域有液泡（A x 6000；B x 10,000）。 (C,D,E) 人类精子的中段异常，显示细胞质滴 (C x 4000；D x 10,000) 线粒体异常 (E x 2400)。 (F) 负染色显示人类精子的尾部异常，显示卷曲的尾部 (x 1400)。 (G,H) 人类精子的负染色显示细菌附着在主片区域 (G x 4000) 和顶体后区域 (D x 5200)[1]。

 

鞭毛变化是孤立的或与头部异常相关。通过负染色可以清楚地看到内部鞭毛亚结构的延伸和走向。超微结构特征的研究和结果的量化变得更加耗时，特别是在大量样本和大量精子中。除了鞭毛缺陷之外，阴性染色还可以清晰地显示头部异常（图2A，B）（空泡），中段异常（细胞质滴，弯曲的颈部和线粒体异常）（图2C；D，E），尾部异常（图 2F）、端件细节（延伸）（图 1 G、H）以及精子上的细菌附着（图 2G、H）。研究表明，除了线粒体和轴丝缺陷之外，第二组中观察到的外层致密纤维发育不良或缺失也可能导致该组的运动性差。

 

[1]Gopalkrishnan, K. Use of negative staining technique and electron microscopy for the study of structural anomalies of outer dense fibres of human flagellum. J. Biosci. 23, 613–616 (1998).

 

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