负染色技术-连续碳膜常规阴性染色

主要的重金属阴性染色有钼酸铵、甲胺、甲胺钒酸盐(Nanovan)、磷钨酸钠/磷钨酸钾、钨硅酸钠、醋酸铀酰、甲酸铀。尽管醋酸铀反应性对生物材料具有阳离子酸度，而且具有水溶液，但它仍然被广泛用作阴性染色剂。它通常是未知样本的初始瞬变电磁筛分或快速初步生物结构质量评估的首选。

醋酸铀酰用于高放大率研究的主要缺点是干燥染色的颗粒/显微晶质特性及其对电子束的敏感性。后者可以通过使用低剂量成像来抵消。甲酸铀酰继续被一些人成功地使用，主要是因为干燥的无定形染色层的更细的颗粒。在阴离子阴性污渍中，钼酸铵被认为是最合适的，尽管在2% (w/v)的水溶液下，它通常比醋酸铀具有更低的质量厚度和更低的图像对比度。

钼酸铵的一个小缺点是，TEM 研究之前的标本储存时间往往被限制在几天内。磷钨酸钠和硅钨酸钠也是公认的阴性染色剂，在这两种情况下都可以产生细粒度的薄层干燥染色，特别是从硅钨酸盐中。甲胺作为一种阴性染色剂，在植物病毒学家中颇受欢迎，但目前还没有得到广泛应用。

另一方面，甲胺钒酸盐发现了作为低对比度阴性染色剂的特殊用途，特别是用于显示与大分子结合的纳米金和十一金颗粒，其他染色剂会掩盖小的金颗粒。在实践中，使用其他一些阴性染色盐的1% (w/v)(或更低)水溶液也可能达到大致相同的结果，特别是如果还包括海藻糖的话。事实上，几乎任何金属盐干燥成非晶态的无定形层都可能具有负染色性质，正如马索沃和马索沃和马什使用硼砂和其他光原子盐所证明的那样。将金属原子如金掺入碳水化合物，如在硫代葡萄糖或使用葡萄糖-磷酸二钠中，产生低对比度的负染色，可能也具有由于碳水化合物的保护性质，但是这种化合物迄今为止还没有得到广泛的使用。

阴性染色过程可以在碳涂层样品网格上生成染色层过厚或过薄的区域，即生物材料仅被部分覆盖并被染色支撑。使用者必须选择一个最佳染色深度，一般取决于一些技术和生物样本的经验，以获得令人满意的图像和有意义的解释 TEM 数据。

海藻糖与阴性染色的包含提供了吸附到碳膜上的分子的优越覆盖，尽管有染色层在某些地方过厚的倾向。一般来说，这不是一个问题，除非在研究的样品网格只包含一个或其他极端的染色深度，这通常不是这种情况。

克服这种染色深度变化的一种方法是使用双层或折叠的碳膜与生物材料和阴性染色夹在两个碳层之间。这种技术的优点是能够提供均匀厚度的阴性染色，而不会在单个颗粒周围产生明显的染色光环，但同时也带来了颗粒变平的相当大的风险。

尽管许多研究人员多年前就已经介绍了这种方法，但 Ohi 等人再次提出了这种方法，他们推荐使用它来产生适合于随后的图像分类的分子图像，尽管分子取向的范围可能受到限制。光系统 II的未染色冷冻水合和阴性染色标本的电子结晶学比较可以强调阴性染色的总体局限性。

图1 连续碳膜吸附生物分子样品的常规阴性染色所产生的 TEM 图像的四个例子。(a)炭疽 PA63保护性抗原的前孔复合物; (b)由具有结合过氧化氢酶分子的阿尔茨海默淀粉样 β 肽产生的纤维; (c)胆固醇平面微晶体和一个胆囊管; (d)具有结合结构域4的胆固醇依赖型溶细胞溶血素的胆固醇微晶体。所有标本均用2% 乙酸铀酰阴性染色。比例尺显示100纳米。

图1给出了吸附在连续碳膜上的生物分子样品的四个阴性染色的例子。炭疽 PA63保护性抗原(图1a) ，由具有结合的人红细胞过氧化氢酶分子的淀粉样蛋白 -β 肽产生的纤维(图1b) ，胆固醇微晶和胆囊圆柱(位于中心)(图1c)和具有结合的溶血蛋白结构域4的胆固醇微晶(图1d)都用2% 乙酸铀染色。

1.Sacha De Carlo, J. Robin Harris, Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM, Micron, Volume 42, Issue 2, 2011, Pages 117-131, ISSN 0968-4328, https://doi.org/10.1016/j.micron.2010.06.003.

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