圆二色谱测试介绍

目前，研究蛋白质和多肽的二级和高级结构的方法主要有X射线晶体衍射、核磁共振和圆二色谱等。前两种方法比较复杂，受多种因素影响，分析比较困难。相对而言，圆二色谱是一种比较简单有效的技术，也是研究蛋白质二级结构的主要手段之一。

圆二色谱仪的工作原理是利用蛋白质的圆二色性和不对称分子对左右圆偏振光的不同吸收来分析蛋白质的结构。蛋白质或多肽中的主要光活性基团是肽键、芳香族氨基酸残基和二硫键。当平面圆偏振光的吸收不同时，会产生吸收差异。由于这种吸收差异的存在，导致偏振光矢量的振幅差异，圆偏振光变成椭圆偏振光，即蛋白质的圆二色性。通过圆二色谱扫描仪可以在一定程度上分析蛋白质和多肽样品的二级结构和高级结构。

要测到准确的蛋白质CD谱，要同时看一看吸收谱，吸收值最好在0.5-2.0之间，这是最主要的参照标准，对浓度没有必然的规定，常见的经验值为浓度在0.1-1.0 mg/ml 之间， 也可以更低或更高。

技术指标

圆二色谱分析的供试品，大多数情况下的蛋白质和多肽。蛋白质的精确浓度是计算样品二级结构的关键，一般要求样品浓度为0.2μg/μl，浓度过高，测试时信号不好，需稀释，样品纯度要在90%以上，不要添加任何保护剂或其它物质，样品中应避免含有光吸收的杂质，缓冲剂和溶剂在配制溶液前最好做单独的检查，透明性极好的磷酸盐可用作缓冲体系。

圆二色谱在远紫外区的扫描图谱，反映的是蛋白质肽键的排布信息，计算所得的是蛋白质二级结构比例，即α-螺旋、β-折叠、转角和不规则卷曲的比例。

圆二色谱在近紫外区的扫描图谱，反映的是蛋白质侧链生色基团色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等残基的排布信息和二硫键微环境的变化。

圆二色谱答疑

1) 圆二色谱的解读。

圆二色谱技术能快速、简单、较准确地研究溶液中蛋白质和多肽的构象，并且运用断流、电化学等附加装置，结合温度、时间等变化参数，已经广泛用于了解蛋白质-配体的相互作用，监测蛋白质分子在外界条件诱导下发生的构象变化，探讨蛋白质折叠、失活过程中的热力学与动力学等多方面的研究。

2) 圆二色谱分析的软件介绍。

圆二色谱在远紫外区的扫描图谱，反映的是蛋白质肽键的排布信息，计算所得的是蛋白质二级结构比例；圆二色谱在近紫外区的扫描图谱，反映的是蛋白质侧链生色基团色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等残基的排布信息和二硫键微环境的变化。

目前用于拆分和估算的软件不下十几种，有几种计算模式被研究者广泛认可。然而，由于不同计算模式的理论基础不同，计算出的蛋白质二级结构比例并不完全相同，但大多数软件都是对α-螺旋的估计还是比较准确的。Apt使用jwsse32软件对样品和对照品的二级结构进行拟合和计算，参考标准曲线采用软件提供的标准α-螺旋（α-螺旋）、β-β折叠片、转角（turn）和不规则卷曲（random coil）曲线。由于预测结构可能存在误差，仅供参考。

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