【摘要】 圆二色光谱（简称CD）是测定蛋白质二次结构最广泛的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的快速、简单、准确的方法。

圆二色谱及其性能参数的比较分析

 

一.简介

圆二色光谱（简称CD）是测定蛋白质二次结构最广泛的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的快速、简单、准确的方法。它可以在溶液状态下测量，更接近其生理状态。而且测量方法快速简单，对构象变化敏感，是研究蛋白质二次结构的主要手段之一，已广泛应用于蛋白质构象研究中。

用于推断不对称分子的构型和构象的旋转光谱。光学活性物质对构成平面偏振光的左右偏振光的吸收系数(ε)是不平等的，εL≠εR，也就是说，它具有圆二色性。不同波长的平面偏振光的波长λ作为横坐标，以吸收系数之差为基础Δε=εL-εR为纵坐标绘图，得到的图谱为圆二色光谱，简称CD。如果一种手性化合物被紫外线可见区域吸收，则可以获得具有特征的圆二色光谱。因为εL≠εR，透射光不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光，摩尔椭圆度[θ]与Δε的关系为：[θ]=3300Δε。圆二色谱也可以以摩尔椭圆度为纵坐标，以波长为横坐标。因为。△ε有正值和负值，所以圆二色谱也有峰值正性圆二色谱和谷物负性圆二色谱。在紫外可见光区域测量圆二色谱和旋转光谱的目的是推断有机物的结构和图像。

 

二．原理

光是横向电磁波，是一种在各个方向振动的射线。其电场矢量E与磁场矢量H相互垂直，并与光波传播方向垂直。由于电场矢量通常产生感光效果，因此电场矢量通常被视为光波的振动矢量。光波电场矢量与传播方向组成的平面称为光波振动面。如果振动面不随时间变化，则称为平面偏振光，其振动面称为偏振面。平面偏振光可分解为振幅和频率相同、旋转方向相反的两个圆偏振光。其中，电矢量顺时针旋转称为右旋圆偏振光，逆时针旋转称为左旋圆偏振光。两束振幅和频率相同、旋转方向相反的偏振光也可以产生一束平面偏振光。如果两束偏振光的振幅（强度）不同，则合成一束椭圆偏振光。

光学活性物质对左右旋圆偏振光的吸收率不同，光吸收的差异ΔA(Al-Ad)这种物质叫圆二色性(circulardichroism,简写CD)。圆二色的出现使通过物质传播的平面偏振光变成椭圆偏振光，只能在吸收的波长处观察到。椭圆的椭圆率θ为:θ=tg-1短轴/长轴

根据Lambert-beer定律，可以证实椭圆率相似：θ=0.576lc(εl-εd)=0.576lcΔε在公式中，L是介质薄厚，C是光活性成分的浓度，εl及εd是物质对左旋和右旋偏振光的吸收系数。测量不同波长下的波长。θ(或Δε)值与波长λ两者之间的关系曲线，即圆二色光谱曲线。在这种光谱曲线中，如果测定的物质没有被特征吸收，它们就会被特征吸收。Δε值很小，即得不到圆二色光谱的特点。当它被用作时。εl>εd时，得到的是一个正的圆二色光谱曲线，即被测物质为右旋，如果被测物质为右旋，εl<εd,得到一个负圆二色光谱曲线，即被测物质为左旋。

根据圆二色光谱法的原理和测试要求设计的仪器称为圆二色光谱仪。目前，圆二色光谱法及其仪器已广泛应用于有机化学、生物化学、配位化学和药物化学领域，已成为研究有机物三维结构的重要方法。

 

三．样品要求

1、样品必须保持一定的纯度，不含光吸收杂质，测定波长时溶剂必须无吸收作用；样品可完全溶解在溶剂中，产生均匀透明的溶液。

2、控制氮气流量

3、缓冲液、溶剂要求和池选择：缓冲液和溶剂在制备溶液前应独立检查，检查波长范围内是否有吸收影响，是否产生沉淀和胶水；在蛋白质测量中，通常选择透明磷酸盐作为缓冲系统。

4、样品浓度和水池选择

样品不同，圆二色光谱范围不同，对池尺寸（光径）选择浓度的要求也不同。蛋白质CD光谱测量通常在相对较薄的溶液中进行。

 

四．谱带总宽

1、选择1nm。对于高分辨率测量，应使用较窄的狭缝总宽度。此时，光电倍增管的电压较高，光谱的信噪比较差。虽然正常测量的最佳光谱带总宽度为1~2nm，但在以下前提下，为了牺牲分辨率，需要较宽的狭缝总宽度。当样品吸光率高但CD信号弱时，一方面要尽量保证测量CD峰所需的充足浓度，另一方面要设置较宽的狭缝。但此时要特别小心，因为样品的吸光率太高(A>2）在这种情况下，可能会出现一些由闪光或杂散光引起的错觉。此外，在固态CD光谱检测中，还需要较大的狭缝总宽度（一般要求>2nm）。

2、椭圆率和摩尔椭圆率都取决于测量条件。因此，应特别注明温度、波长和样品浓度。

3、当用压片法或石蜡油研磨法进行固体粉末样品测试时，要尽可能地研磨获得细小均匀的样品颗粒。采用石蜡油糊方法时，必须注意某些憎水有机化合物可能溶于石蜡油中，这时所得CD光谱在某种意义上应视为溶液CD光谱。采用压片法测试固体CD时，在保证手性样品的定性浓度达到CD光谱仪检测要求的同时，片越薄越透明越好(但切忌破损)。在某些情况下，压片法不适用于手性抗衡阴离子存在下的固体诱导CD光谱的测定。