NMR的原理与分析

NMR的基本原理

核磁共振（NMR）是指自旋量子数不为零的原子核（比如¹H、¹³C、²⁷Al、²⁹Si等）在静磁场（B₀）作用下，核自旋能级发生塞曼（Zeeman）能级裂分，其能级差为：ΔE = ħω₀，若对该体系施加一个垂直于静磁场方向且能量等于相邻能级间能量差的射频场（B₁）时，核自旋能级间产生共振跃迁的过程。自旋核在射频场作用下会绕静磁场B₀旋转，称为拉莫尔（Larmor）进动。Larmor频率ω的大小取决于原子核的种类和外磁场的大小：ω = γB₀。

NMR实验常用测量参数

（1）化学位移和J偶合

化学位移作用，也称屏蔽作用，是指在磁场中，由于原子核外电子的运动而产生一个小的磁场B_e（local field），此小磁场与外加磁场B₀方向相反，从而使原子核感受到一个比外加磁场小的磁场的现象。一方面，分子中不同原子核周围电子屏蔽效应不同导致不同原子核感受到的外磁场强度不同；另外，由于邻近核自旋的影响，在不同化学环境中相同自旋核的拉莫尔频率也会出现偏差。因此化学位移能够反映原子核在分子中的化学环境或原子核附近的电子云密度分布，可作为鉴别或测定化合物结构的重要依据。化学位移（δ）是相对值，一般情况下会选择一个标准物质，比如四甲基硅烷（TMS）的质子化学位移作为标准。

J耦合，即自旋-自旋耦合作用，指相邻原子核通过化学键（电子云）发生的作用。两个自旋核之间的耦合作用大小称为J耦合常数。J耦合会引起共振峰的分裂而形成多重峰；多重峰包含了相互作用的原子核彼此间的空间结构信息。

化学位移和J耦合常数是NMR中很重要的两个参数。不同化学基团上的¹H或者¹³C的化学位移不同，不同分子结构的物质中J耦合裂分方式也不同，这些差异为NMR应用于分子结构解析奠定了坚实的基础。

（2）弛豫时间

当磁化矢量在某一时间受到外界扰动时，其磁化矢量即处于非平衡状态，当扰动去除后，磁化矢量就要向着平衡方向移动，这一过程称为弛豫过程。弛豫时间分别为纵向弛豫时间（T₁）和横向弛豫时间（T₂），也分别称为自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间。其中，T₁是纵向磁化强度向平衡状态恢复的时间，T₂是横向磁化强度向平衡状态恢复的时间。弛豫时间与核之间的化学位移各向异性、偶极-偶极相互作用、四极相互作用等方面有关。通过测量弛豫时间，不仅可以获得分子运动性的相关信息，还可以获得常规液体谱图上无法获得信息，例如各向同性液体样品中的偶极-偶极耦合信息。弛豫时间的测定是许多NMR实验的基础。

（3）自扩散系数

自扩散，是一种无规则的运动，类似于布朗运动，是指均匀分布相同粒子下的单个粒子的运动，其周围的粒子都是随机的，即在不存在化学势梯度时的扩散运动。自扩散系数是用来衡量分子运动快慢的重要参数。假设分子为球形，其处于粘度为ƞ的连续介质中的扩散系数可以用Stokes-Einstein方程描述：

其中，D为自扩散系数，k为Boltzman常数，T为绝对温度，R_H为球形分子的水合动力学半径。从公式中可看出，自扩散系数大小与分子形状尺寸、体系温度、溶液粘度及分子间相互作用等密切相关，也就是说，任何能够改变分子整体运动状态的物理或化学变化都可在自扩散系数上表现出来。因此，可通过测量自扩散系数来研究各种体系中分子的聚集状态及分子间相互作用等。

随着脉冲梯度场技术的发展，用NMR测定分子自扩散系数已经成为NMR动为学中的重要组成部分。

（4）二维同核NMR实验

COSY谱（Correlation Spectroscopy）是最简单且用途最广的二维实验。COSY是通过J耦合建立的自旋核与自旋核之间的联系，也叫化学位移相关谱。同核COSY谱图中的交叉峰表明了邻近同核原子之间的耦合。另外，当一维谱图中谱峰重叠或变宽导致谱图难以解析时，COSY可以辅助谱峰信号的归属。COSY实验不仅可以用于观察¹H-¹H等同核原子之间的相关性，还可用于关联其他元素的化学转移。

TOCSY（Total Correlation Spectroscopy）实验可以提供整个自旋体系的信息，通过特殊的脉冲序列，实现从一个氢核的谱峰出发，找到与它处于同一耦合体系的所有氢核的相关峰。TOCSY实验中，磁化矢量在整个自旋系统内转移，混合时间的长短决定磁化矢量转移的远近；混合时间越长，磁化矢量传递越远，而混合时间很短时，TOCSY谱相当于COSY谱。

二维NOESY（Nuclear Overhauser Enhancements Spectroscopy）实验主要用于谱峰归属、结构的确定、立体构型及构象的研究。有机分子中两个¹H核（例如H_A和H_B）的空间距离非常相近（通常指3.5Å以下）时，照射H_A至饱和，则H_A信号消失，而H_B的信号强度增大，这种现象称NOE效应。是由于空间靠近的核自旋之间的交叉弛豫引起的。NOE的强弱直接与相互作用的原子核间距离有关，因此NOE在分子结构计算中往往用于提供原子间距离和空间结构的信息。NOESY实验经常被用来确定一些生物大分子的构象，如蛋白质，核酸，DNA，RNA等。

原子核在外磁场中的Zeeman分裂所造成的能级差非常小，处在低能级的核自旋吸收外加射频场能量跃迁到离能级后靠自发辐射再回到低能级的效率非常低。因此NMR中核自旋的弛豫主要靠和它周围偶极子的相互作用。

（5）二维异核NMR实验

异核相关实验中最常用的是¹³C-¹H耦合系统，此外¹⁵N-¹H，²⁹Si-¹H系统也得到广泛的应用。异核二维相关实验是直接观测¹³C、¹⁵N等不灵敏核并获得它们与¹H之间耦合相关信息的重要手段。但是因为¹³C、¹⁵N等杂原子的天然丰度低且旋磁比低，NMR信号非常弱，一维谱采样便较为困难，二维谱则需要占用更长的时间，这严重影响了异核二维相关实验的广泛应用。

HMQC（Heteronuclear Multiple Quantum Correlation，异核多量子相关）实验是通过检测¹H信号而达到间接测¹³C或者¹⁵N信号的一种方法。对于浓度很稀的样品，直接测得一维¹³C谱往往需要十几个小时，而测¹⁵N谱几乎不可能，可是用HMQC方法测小分子的¹³C-¹H相关谱图一般只需要1-2小时，测¹⁵N-¹H相关谱图用大半天也可以取得较好的结果。不仅如此，而且获得的结果是二维相关谱，从中可以直接获得异核耦合的信息，大大方便了信号的归属。

HSQC（Heteronuclear Single Quantum Correlation，异核单量子相关）实验可以给出直接相连的碳氢相关信息，而不能解决碳与季碳相连的问题，或隔碳相连的问题。HSQC与HMQC的谱图相同，都是显示¹H核和与其直接相连的¹³C核的相关峰，其作用相应于C,H-COSY谱；其中HSQC谱图中F1维分辨率比HMQC高，但脉冲序列更为复杂。

HMBC（Heteronuclear Multiple Bond Correlation，异核多重键相关）实验仍以HMQC实验为基础，脉冲序列由四个简单HMQC脉冲序列组成，只不过长程耦合常数比单键耦合常数小很多而已。相邻2键或者3键的¹³C-¹H耦合常数一般为5-10Hz，实验中只要按J=7.5Hz设定为70ms，就可达到HMQC的实验目的。因此HMBC实验本质上说是借助于较小耦合常数完成的HMQC实验，在演化过程中也是多量子相干在起作用。与HMQC谱中一个¹H峰只能与一个¹³C峰相关不同的是，在HMBC中，一个¹H峰可以与多个¹³C峰相关。HMBC实验主要用于解决四级碳信号的问题。

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