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细胞增殖及毒性检测
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项目简介
一、简介：
细胞毒性检测是生物相容性测试的一种，检测药物或者新型材料在生物环境中的毒性情况，即通过检测材料或者药物对细胞的增殖或者生长的影响，来评价药物或材料的毒性或者活性。主要用于药物活性筛选、细胞增殖/毒性测定、抗肿瘤药效计算IC50等；常用MTT法或者CCK8法检测，另外也可以通过Live/dead双染法进行细胞成像，更直观的记录细胞的存活情况。
（一）CCK8测试
1. 实验原理
CCK-8（cell-counting kit-8）检测试剂盒是应用WST-8取代MTT被还原，WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。应用酶标仪测定吸光值（450nm）并进行统计学计算便可以获得细胞毒性相关数据。
2. 参考标准
GBT16886.5-2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验；
ISO 10993-12 2007。
3. 实验流程图
（二）MTT测试
1. 实验原理
哺乳动物胞的线粒体酶可将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色的物质，用二甲基亚砜（DMSO）将其溶解成溶液，用酶标仪测定其浓度（570nm），从而定量测定细胞的存活比例。
2. 实验流程图
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结果展示
一、细胞毒性交付结果
1. 交付内容
（1）将各组吸光度值输入Excel并计算相对活力（相对活力%=实验组OD值/对照组OD值均值×100%，将相对活力数值输入GraphPad Prism作图，结果如下：
<图1> 不同浓度下细胞的相对存活率，注：与control组比较，**P＜0.01
二、细胞死活染色-激光共聚焦交付结果
1. 交付内容
2D模式拍摄：每个样品3-4张图片，其中①若一个样品拍摄1个倍数，拍4个视野②若一个样品拍摄2个倍数，各拍摄2个视野③若一个样品拍摄3个倍数，各拍摄1个视野。
2. 结果展示
<图2> 荧光显微镜下live/dead染色显示死细胞及或细胞分布
<图3> 激光共聚焦扫描显微镜下live/dead染色显示死细胞及或细胞分布
样品要求
1. 块体类—薄膜、布料、金属块、纸片、凝胶等
（1）送样量：a. 与细胞的作用方式为直接接触的话，至少3个/种细胞/时间点；b.样本处理方式为浸提的话，可参考国标ISO 10993-12 2007中的浸提方式浸提，根据浸提方式按量和检测时间点提供；
（2）制样要求：若是需要把细胞接种到材料上的话，金属块、凝胶类样本须制备成统一大小的圆形/方形，建议制备直径为5-7 mm圆形。布料、纸片类样本可代为裁剪，默认制备直径为6 mm。
2. 液体类
送样量：根据测试时样本浓度和检测时间点而定，按照单次检测需要的3-5倍的量寄送；若采用稀释后样本测试，则须告知稀释倍数及工作液浓度；若溶剂为有机溶剂（如DMSO，醇类，酚类等），最高工作液浓度中，溶剂的占比低于0.5%。
3. 粉末类
送样量：根据测试时样本浓度和检测时间点而定，按照单次检测需要的3-5倍的量寄送；其中：
a. 可溶性粉末：注明溶剂的种类（如无水乙醇，异丙醇，DMSO，培养基，PBS或者生盐水等），当样品对溶剂有特殊需求时，请在送样时附加所需溶剂；
b. 不可溶粉末：注明样本性质，灭菌方式，及分散为均匀悬浮液所需必要步骤，
<如果不可使用分散液，需要预试，样本量可联系本公司人员确认>
注：测试时，默认每组3个平行，每孔培养基加样量100μL。
常见问题
1. MTT法检测细胞活性的原理？
哺乳动物胞的线粒体酶可将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色的物质，用二甲基亚砜（DMSO）将其溶解成溶液，用酶标仪测定其浓度（570nm），从而定量测定细胞的存活比例。
2. CCK8法检测细胞活性的原理？
CCK-8（cell-counting kit-8）检测试剂盒是应用WST-8取代MTT被还原，WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。应用酶标仪测定吸光值（450nm）并进行统计学计算便可以获得细胞毒性相关数据。
3. 灭菌方法怎么选择？
目前可以开展高温高压蒸汽灭菌、紫外照射灭菌和过滤除菌等。高温高压蒸汽灭菌（121℃、20min），最彻底的灭菌方法，推荐用此方法灭菌；或者酒精浸泡（30min），但样品不能溶于酒精；另外紫外照射灭菌（30min），不太彻底，如需延长照射让灭菌更彻底需要提前告知；如果是液体样品也可以采用过滤除菌（0.22μm的过滤器），可以除去大部分微生物。
4. 样品制备时采用直接接触和浸提液有何区别？
a) 浸提液试验：浸提液试验是使用浸提介质浸提样品，然后通过浸提液与细胞接触来评价细胞毒性的方法，用于细胞毒性定性和定量评定。ISO 10993-12标准升版之后，长期(>24小时，<30天)和持久(>30天)接触的样品在进行细胞毒性评价时，推荐的浸提时间是72小时，因为浸提24小时可能不足以使那些使用超过24小时的器械上的化学物质充分释放。
b) 直接接触试验：直接接触试验是通过样品直接与细胞接触来评价细胞毒性的方法。固体样品可直接置于细胞层与细胞接触，液体样品可直接放置；或放置到生物惰性吸水性的基质上与细胞接触。
5. 如何选择用MTT法或CCK8法？
MTT：适用贴壁细胞；
CCK8：适用于贴壁细胞和悬浮细胞，与MTT或其它MTT类似产品如XTT和MTS等相比，使用方便，线性范围相对宽，灵敏度更高，重复性也优于MTT，如样品容易沉淀或残留且易溶于DMSO，建议选用CCK8法检测。
6. 寄送样品量不足
如果寄送样品量不足，会造成反复寄样，影响您的实验周期。所以建议根据上述的《样品要求》准备样品量，若遇到样品量不太确定时，可与工作人员联系。
7. 浸提液常用国标ISO 10993-12 2007介绍
| 浸提液制备标准-表面积/浸提液体积 | ||
| 厚度（mm） | 浸提比例 （表面积或体积） ±10% |
材料形式举例 |
| ＜0.5 | 6 cm2/ml | 薄膜 |
| 0.5-1.0 | 3 cm2/ml | 金属薄片、硅片 |
| ＞1.0 | 1.25 cm2/ml | 金属块 |
| 不规则固体材料 | 0.2 g/ml | 粉末、粒状、泡沫、非吸收剂 |
| 不规则多孔材料 (低密度材料) |
0.1 g/ml | 薄膜、海绵 |
| 注意：目前还没有标准的浸提方法来测试吸收剂和吸水溶胀的水溶胶类样本。 | ||
相关资料
【1分钟学实验】细菌活死染色结果怎么看？.pdf
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